DNA多态性及其分析.ppt

（3）重复序列探针 如α小卫星DNA，其重复单位群集在基因组的某一特定区域。 重复序列探针能检测出基因组中多处具有此类重复序列的DNA片段。 特点：能一次性检测出多个位点的DNA片段多态性 Jeffreys等从第22号染色体上肌红蛋白基因的内含子中分离出来的高度可变的“小卫星DNA”探针。 并证明两个无关个体之间，这类多态性相同的机会极微（只有3×10－11），因而他称这种RFLP图谱为DNA“指纹”。 应用： 亲子鉴定 法医学个人认定 人类学研究 遗传病相关性分析 将总DNA用限制性内切酶完全酶解以后，用放射性的探针进行Southern印迹，每个人的DNA所产生的阳性杂交条带都是特异性的，而且子女的阳性杂交带中，有一半与父亲的DNA阳性杂交带相同，另一半是与母亲的阳性杂交带相同。 用这种重复序列作为探针，对不同的人的DNA进行指纹分析，产生完全相同的图谱的机会小于60亿分之一。可用于法医鉴定、血缘关系的识别等。 这一实验方法所提供的证据已于1988年得到英国法庭的认可。 人的DNA指纹分析示意图 子女DNA指纹图中分别与其父、母的DNA指纹中 相应的分子杂交条带相对应 （4）人工合成的寡核苷酸探针 1986年，Ali等以 Alu I 和 Mbo I 酶消化人基因组DNA后，用人工合成的（GATA）的寡核苷酸作探针进行检测，发现其RFLP图谱同样具有个体特异性。 这类探针检测的对象主要是人基因组中的散在重复序列DNA。 提示：根据自己研究的主要对象来设计各种各样的探针（包括各种长度的以及各种碱基组成的）。人基因组DNA用合适的探针和限制性内切酶酶切，一般都能揭示出人基因组中的RFLP。 在其它动物的研究中： 在动物基因组中任选一段DNA片段 作为探针 再用此探针去检查该动物基因组的限制性酶切片段长度多态性。 许多昆虫类动物可以用此方法进行种、群分类。 1. 检测对象的DNA分子必须保持大分子。在抽提DNA过程中避免人为地将DNA分子机械性切割成小片段的DNA，否则最终的结果可能是一种假象。 2. 在用限制性内切酶消化大分子DNA时，要使DNA被完全消化，否则也会出假结果。 3. 被消化的DNA浓度不能太高。 4. 电泳时要低电压电泳。 5. 杂交前探针必须充分变性。 6. 要根据探针标记的情况以及探针与靶DNA间序列互补的程度和GC含量来掌握洗膜的条件。 7. 作放射自显影时，要根据探针标记的放射比活性以及靶DNA的量等因素决定曝光的时间。 注意 二．PCR分析DNA多态性 PCR（polymerase chain reaction）是一种在试管里扩增特定的DNA片段的技术。 设计引物：按照所研究的DNA（称靶DNA）片段的特点，设计出与此DNA片段二翼的DNA序列互补的寡核苷酸。 变性：通过加热（92~95℃）使靶DNA（又称DNA模板）变性成为两条单链DNA。 退火（复性）：然后将温度降至37℃~55℃，引物就会结合在模板DNA中与其碱基互补的序列上。 延伸：将温度升至70℃~72℃，在Taq DNA聚合酶的作用下，引物就会按5’→3’的方向，严格按照碱基互补的原则，逐步延伸。 1．分析基因多态性 方法： 特异性引物 扩增 特异性基因片段 与此位点上所有的 等位基因探针都杂交 确定属哪个等位基因 等位基因间的差异一般表现为几个碱基或十几个碱基组成的不同，因而区分这些不同的等位基因多采用等位基因特异性探针（allele-specific oligonucleotide probe，ASO）与扩增出来的DNA片段进行杂交，根据能与哪一个探针进行杂交来确定该DNA片段属哪一个等位基因。 人类HLA系统——已知有30多个位点，超过500个等位基因。其中的某一位点，往往有多个、甚至几十个等位基因。 难以实现 多态性的分析 2．分析扩增DNA的限制性片段长度多态性 扩增DNA的限制性酶切片段长度多态性（Amplification restriction fragment length polymorphism ,简称Am - RFLP）技术 概括为：PCR+酶切 应用举例：串联重复序列的核心很短（只有4～5bp），重复次数的差异又不大时，其扩增产物的长短较为接近，用普通琼脂糖凝胶电泳难以区分开来。 这时可以根据扩增片段碱基组成的规律，选择某种限制性内切酶对扩增片段酶切。这种酶切片段的长度差异往往较大，可以用琼脂糖凝胶电泳区分出不同的等位