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2012级本科分子生物学实验设计 年级、专业、班级： 实验课时间： 实验室： 组别： 组员排名（按姓氏排名）： 报告人： 患儿，男性，3岁，因面色苍白伴血尿1天入院。1天前食用新鲜蚕豆后，今日出现恶心、呕吐、排尿呈酱油样色，面色苍白。据家长反映，患者的姐姐也曾发生过类似情况。 体格检查：体温38℃，脉搏150次/分，呼吸40次/分，血压80/60mmHg，呼吸急促，神清，萎靡，面色苍白，皮肤及巩膜黄染，体型较同龄人瘦小。心、肺未及异常，肝、脾未触及，双肾区无叩击痛，神经系统检查未及异常。 实验室检查：红细胞 1.98×1012/L，血红蛋白53g/L，血清总胆红素85.5μmol/L，结合胆红素13.7μmol/L，未结合胆红素71.8μmol/L，尿蛋白（++），潜血(+)，尿胆红素(－)，尿胆素原(+)，尿液镜下未见红细胞。 案例 ： 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症 （俗称蚕豆病） 初步诊断为： 诱因：一天前食用蚕豆 既往史：姐姐也曾出现过此症状 临床表现：皮肤及巩膜黄染、尿液呈酱油样 蚕豆病发病机制 食用蚕豆 产生大量过氧化氢，不被清除 红细胞膜脂质被氧化破坏 急性血管内溶血，产生过多胆红素 导致溶血性黄疸，恶心，呕吐，尿液呈酱油样 红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性测定 【实验目的】 检测患者体内葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的活性以及发病原因 掌握紫外法测定 G6PD活性的原理及方法 了解蚕豆病的发病机制及原因 【实验原理】 G6P G6PD 6PGA NAPD NADPH 340nm,最大吸收峰 A340 血红蛋白 氧化 高铁血红蛋白 540nm,最大吸收峰值 A540 } 比色法 G6PD活性 【实验器材与试剂】 器材： 取血针、恒温水循环紫外分光光度计、可见分光光度计、离心机 试剂：生理盐水、缓冲液、NADP+、G6P-Na2、溶血剂、血红蛋白氧化剂、0.9％NaCl、ACD抗凝剂 【实验步骤】 1.洗涤红细胞：取血2.0mL放入0.4mLACD抗凝剂的试管 0.2mL抗凝血，4mL预冷的生理盐水，离心﹙2500r/min,5min﹚ 沉淀 2.溶血液的制备： 2.0mL溶血剂，震荡1min，4℃放置10min 待测定 试剂 体积 蒸馏水﹙μL﹚ 2024 0.5mol／L Tris-HCL MgCL2缓冲液溶液﹙μL﹚ 300 6 mmol/G6P-Na2﹙μL﹚ 300 2mmol/LNADP+﹙μL﹚ 300 混匀后放入带恒温水循环（25℃）的紫外分光光度计中，预热10min，然后在“测定”中加入溶血液60μL，“空白”中加入“溶血剂”60μL，混匀 以“空白”调零，1min后测A340，每2min记录吸光度一次至10min,比较每2minA值的变化情况，若相近则表明酶促反应平稳。并计算平均变化的A值。 3.取石英比色杯两只，标为“测定”及“空白”，按下表操作： 试剂 体积 Drabkin(ml) 3.0 溶血液(ml) 0.3 混匀，室温放置15min,以Drabkin试剂调零，读取540的吸光度（A540）。 4.溶血液中血红蛋白含量的测定 取试管一支，按下表操作： 【实验结果】 1.NADPH产量的计算： NADPH在340nm处，其每微摩尔的吸光系数（ε）为6.220，故10min内MADPH的产量计算公式为： NADPH产量﹙μmoL﹚= A340 6.22 2.血红蛋白含量的计算： 血红蛋白氧化为高铁血红蛋白以后，在540nm处，其毫摩尔的吸光系数（ε）为44，故溶血液中血红蛋白的含量计算公式为： 血红蛋白含量(mmoL)= A540 44 3.G6PD比活性的计算： G6PD比活性单位(U/gHb)= A340 A540 ×49.85 【参考范围】 G6PD缺陷者：G6PD活性较正常平均值低40%以上即可作出诊断 【结果分析方法】 大于2. 8U/gHb 【注意事项】 1、洗涤红细胞时禁止剧烈震荡，避免溶血。 2、测定NADPH时读取吸光度的时间要准确。 1. 血尿、排酱油色尿、面色苍白 2. 皮肤及巩膜黄染 3. 体温升高 4. 呼吸急促 主要临床表现： 1. 血尿、排酱油色尿、面色苍白 G6PD↓ GSH的主要作用： ① 保护红细胞内的含硫氢基 （-SH）血红蛋白、酶蛋白和膜蛋白的完整性，免遭氧化 ② 与谷胱甘肽过氧化酶共同使H2O2还原成H2O →NADPH+H+↓ →红细胞的抗氧化能力↓ →GSH↓ →红细胞 膜破裂 →溶血性贫血（面色苍白） →游离Hb →血红蛋白尿 2. 皮肤及巩膜黄染 3. 体温升高 机理： 红细胞破裂 ↓ 血红蛋白暴露