双抗夹心ELISA测沙门氏菌().ppt

经典的化学分析方法（滴定分析、重量分析、简单的吸光光度法）是以简单离子或分子为检测对象的常量或微量分析，面对生物体系成分复杂且待测物浓度较低的测试条件则往往无能为力。 于是，一系列针对生物体系中化学成分的测量方法应运而生。免疫化学分析即其重要成员，它将免疫学知识与化学分析手段有机结合，为生命体系中高特异性、超微量的分析提供了解决方法。 免疫标记技术：将抗原-抗体反应与标记技术相结合，用放射性同位素、酶或荧光素标记的已知抗体或抗原，通过检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体。 酶结合物是酶与抗体或抗原, 半抗原在交联剂作用下联结的产物。是ELISA成败的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物 ，将得到不同的颜色反应. 实验四双抗夹心ELISA检测沙门氏菌 实验目的 掌握酶联免疫吸附实验的基本原理 了解利用双抗体夹心法测定沙门氏菌的方法 ELISA简介 1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定法,即酶联免疫吸附测定法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA)。 ELISA现在已成为目前分析化学领域中的前沿课题 ，它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶技术的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术 。 免疫标记技术 放射物标记技术 酶标技术 免疫荧光技术 其他标记技术 酶联免疫吸附技术 酶免疫组化技术 双抗体夹心法 间接法 竞争法 双抗原夹心法 双位一点法 ELISA的特点 一.灵敏性 其灵敏性来自酶的高效催化特性，产生可供观察的显色反应现象。 ELISA实现了在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体，或在微克、甚至纳克水平上对其进行定量。 二.特异性 其特异性来自抗体或抗原的专一性结合。 三.简单、快速及易于自动化操作  抗生素的测定(如新霉素,氯霉素等) 微生物毒素的测定（如黄曲霉毒素,赭曲霉毒素等） 违法添加剂的测定(如盐酸克伦特罗,孔雀石绿等) 疾病诊断(乙肝病毒,风湿性关节炎等) ELISA在饲料安全检测中的应用 其他应用 微生物的检测(如沙门氏菌, 大肠杆菌O157:H7,金黄色葡萄球菌,李斯特氏菌,致病性弧菌等) 动植物毒素(如河豚毒素,吗啡,藻类毒素等) 农药农残检测 ELISA在食品安全检测中的应用 ELISA试剂盒 固相载体 最常用的是聚苯乙烯：有较强的吸附蛋白质的性能； 国际上标准的是微量滴定板8×12的96孔板式； 已经包被抗原或者抗体的固相载体在低温（2-8℃）干燥的条件下一般可以保存6个月。 酶 底 物 显色反应 测定波长 辣根过氧化物酶 邻苯二胺四甲基联苯胺(TMB)氨基水杨酸邻联苯甲胺2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐 橘红色黄色棕色兰色蓝绿色 492 450 449425642 碱性磷酸酯酶 4-硝基酚磷酸盐(PNP)萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐 黄色红色 400500 葡萄糖氧化酶 ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰 黄色深蓝色 405 420 β-Ｄ－半乳糖苷酶 甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)硝基酚半乳糖苷(ONPG) 荧光黄色 360,450420 酶及其底物 酶结合物是酶与抗体或抗原, 半抗原在交联剂作用下联结的产物。是ELISA成败的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物 ，将得到不同的颜色反应. DNM-9602G酶标分析仪 DNM-9602 标配酶标分析仪 DNM-9602A酶标分析仪 几种酶标分析仪 ELISA的基本原理 它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。 在这种测定方法中有3种必要的试剂： ①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂） ②酶标记的抗原或抗体（标记物） ③酶作用的底物（显色剂） 测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保留其免疫活性。然后加一种抗体（抗原）与酶结合成的偶联物（标记物），此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性。当偶联物与固相载体上的抗原（抗体）反应结合后， 再加上酶的相应底物，即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色，其所生成的颜色深浅与欲测的抗原（抗体）含量成正比。 双抗体夹心法 原理 此法适用于检验各种