细胞生物学研究方法PPT.ppt

2.6.4 选 择 性 基 因 剔 除 和 转 基 因 鼠 概念；基因剔除是用DNA重组技术剔除或破坏生物体基因组内某一特定基因，而后观察由此引起的表型改变。这样，可以了解该基因的生物学功能。 现以小鼠为例，先将待剔除的基因制成缺失突变型，在缺失的位置上插入一个选择基因如新霉素抗性基因(neo)，同时再接上另一个选择基因如胸苷激酶基因(tk)。将这一段带有已失去原有功能的待剔除基因的DNA片段装在载体上，转入在体外培养的小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells，ES cells)。在细胞内，通过同源重组将基因组里有功能的待剔除基因置换掉，也就是被剔除了。 流式细胞仪结构 细 胞 生 生 物 学 研 究 方 法 第二章 班级：09级1班 学号： 人 生 格 言：既然选择了远方就要风雨兼程！ 本 章 概 括 显微成像技术 细胞化学技术 细胞分选技术 细胞工程技术 分离技术 分子生物学方法 2.1 显 微 成 像 技 术 发展史：1590年，Z.janssen和他的侄子H.janssen共同研制出最早的光 学显微镜。后来，胡克和列文虎克相继提高了光学显微镜的分辨率，观察 到了细胞的结构。 2.1.1 光 学 和 电 子 显 微 镜 照明系统 被观察的样品 聚焦和成像的透镜系统 光学显微镜和电子显微镜的主要区别： 光源不同 使用的透镜不同 装置的设计不同 电子显微镜要在真空条件下 2.1.1.1 分 辨 率 两个物点间最小距离的能力 这种距离成为分辨距离。是透镜最重要的性质 其中：n=聚光镜和物镜之间介质的折射率，空气为1，油为1.5 α?=样品对物镜孔径角的半角， sin?α的最大值为1λ=照明光源的波长 0.61是一个恒定的参数，表示成像的点虽被重叠担仍能被区分的程度 2.1.1.2分辨极限和放大率 最终成像的大小与原物大小的比值称为放大率 可见光的波长的限制光学显微镜的最高分辨率 2.1.2 常 见 的 光 学 显 微 镜 普通双筒显微 荧光显微镜 相差显微镜 暗视野显微镜 倒置显微镜 偏光显微镜 荧光显微镜(Fluorescence microscope) 荧光显微镜是以紫外线为光源， 用以照射被检物体， 使之发出 荧光， 然后在显微镜下观察物体的形状及其所在位置。荧光显微 镜用于研究细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分布及定位 等。 倒置显微镜（inverted microscope ） 组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞，具有相差物镜。 相差显微镜(Phase contrast microscope 相差显微镜由P．Zernike于1935年发明，并因此获1953年诺贝尔物理学，这种显微镜最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞。  差显微镜具有两个其他显微镜所不具有的功能:①将直射的光(视野中背景光)与经物体衍射的光分开;②将大约一半的波长从相位中除去，使之不能发生相互作用，从而引起强度的变化。 暗视野显微镜（dark field microscope） 暗视野显微镜又叫暗场显微镜，是一种通过观察样品受侧向光照射时所产生的散射光来分辨样品细节的特殊显微镜。 暗视野显微镜主要用于检查未染色标本的形态和运动能力。暗视野显微镜和一般的明视野显微镜区别在于二者的聚光器不同，暗视野显微镜装有一个中央遮暗的聚光器，使光线不能通过聚光器，而只能从聚光器四周边及未遮暗的部位斜射到载玻片的标本上。因光线是斜射的，不能进入物镜，故观察的视野是暗的，而聚光器斜射到菌体上的光线，因光散射作用而使菌体发出亮光，反射到物镜内，这样在显微镜中可见到暗视野 2.1.3 光学显微镜的样品制备 样品可粗略的分为两类：整体和切片 步骤： 1、样品的固定 杀死细胞、稳定细胞的化学成分 2、包埋和切片 液体的石蜡或树脂做包埋剂，使之渗入整块组织，硬化成固体包埋块，然后切割 3、染色 给细胞的不同组分带上可区别的颜色特征 2.1.4电子显微镜（electron microscope） 电子显微镜（electron microscope），简称电镜，是使用电子来展示物件的内部或表面的显微镜。1932年，德国学者Knolls和Ruska发明了第一台电子显微镜，开拓了超微世界。观察到了亚显微结构，即超微结构。 到了二十世纪40年代，美国的希尔用消像散器补偿电子透镜的旋转不对称性，使电子显微镜的分辨本领有了新的突破，逐步达到了现代水平。在中国，1958年研制成功透射式电子显微镜，其分辨本领为3纳米，1979年又制成分辨本领为0.3纳米的大型电