酶工程复习材料 简述凝胶层析、亲和层析、离子交换层析.doc

酶工程复习材料 简述凝胶层析、亲和层析、离子交换层析的原理和操作要点？ 离子交换层析原理：根据待分离物质带电性质不同的分离纯化方法。 操作:a上样：上样体积不十分严格。b洗脱:增加溶液的离子强度 c梯度洗脱法:改变溶液的pH d再生：用0.5mol/LNaOH和0.5mol/L NaCl混合溶液或0.5mol/L HCl处理。 凝胶层析原理：利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同。大分子物质不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；小分子物质可自由出入凝胶孔，流程长而后流出层析柱。 操作：a凝胶的选择和处理,根据相对分子质量范围选择相应型号的凝胶介质。 将干胶悬浮于5-10倍的蒸馏水中 ，充分溶胀，抽气，装柱。b柱的选择:采用L/D比值高的柱子，可提高分辨率，但影响流速。c加样:体积不能过多，不超过凝胶床体积的5％，脱盐时可在10％左右。d洗脱:洗脱液与平衡时用的buffer一致。洗速不可过快，保持恒速。e胶的保存:洗脱完毕后，凝胶柱已恢复到上柱前的状态，不必再生处理。 亲和层析原理:利用生物大分子间特异的亲和力来纯化生物大分子.体通过适当的化学反应共价的连接到载体上，待纯化的物质可被配体吸附，杂质则不被吸附，从层析柱流出，变换洗脱条件，即可将分离的物质洗脱下来，实现分离提纯。 酶的分类： 根据酶的化学组成可将酶分为：1.单纯蛋白酶类：只含有蛋白质成分；2.结合蛋白酶类 （全酶）：含有蛋白成分（酶蛋白）和非蛋白成分（辅助因子） 全酶 = 酶蛋白 + 辅助因子 根据酶蛋白结构特点可将酶分为 单体酶：以一个独立的三级结构为完整生物功能分子的最高结构形式的酶。 寡聚酶：以一个独立的四级结构为完整生物功能分子的最高结构形式的酶。 多酶复合体：由多种酶彼此镶嵌成一个功能完整的具有特定结构的复合体, 它们相互配合依次进行，催化连续的一系列相关反应。 酶合成调节的类型 诱导: 组成酶：细胞固有的酶类。 诱导酶：是细胞为适应外来底物或其结构类似物而临时合成的一类酶。 阻遏:分解代谢物阻遏和反馈阻遏 酶合成的调节机制：1.酶合成的诱导：加进某种物质，使酶生物合成开始或加速进行。 2.末端产物阻遏：由某代谢途径末端产物的过量累积引起的阻遏。 3.分解代谢物阻遏：指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮源）存在时，利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。 酶发酵动力学：主要研究发酵过程中细胞生长速度，产物生成速度，基质消耗速度以及环境因素对这些速度的影响等。 产酶动力学：主要研究细胞产酶速度以及各种环境对产酶速度的影响规律。分为宏观酶动力学和微观酶动力学 细胞破碎确认： 1.直接测定破碎前后的细胞数：破碎前，用显微镜或电子微粒计数器直接计数； 破碎后，用染色法区分破碎细胞与完整细胞。 2.测定导电率：利用破碎前后导电率的变化测定破碎程度。 3.测定释放的蛋白质量或酶活力： 测定破碎液中胞内蛋白质或目的酶的释放量，估算破碎率。 固定化酶特点：1、不溶于水:反应完成后，经过滤或离心等简单分离，就可以回收，以重复使用，降低酶制剂成本。2、具有一定的机械强度: 可将其装成酶柱，当底物溶液缓缓流经酶柱时，就能发生酶促反应，流出液中，即含有酶促反应产物，其产物不易带杂质，收率高，易精制。3、稳定性提高:一根酶柱往往可以连续使用数十次，而酶活力并无明显下降。 固定化酶的性质: 1. 稳定性2. 最适温度3、最适pH 4、底物特异性 稳定性：固相酶的稳定性比游离酶高，主要表现在以下几个方面。 （1）热稳定性：固定化酶热稳定性较之天然酶提高。如氨基酸酰化酶 (2) 对蛋白酶水解作用稳定性：固相酶比天然酶有更强的抵抗蛋白酶水解作用的能力。 （3) 对变性试剂作用的稳定性：固相酶对各种蛋白变性剂的稳定性，一般都比天然酶强。 (4) 保藏稳定性：固相酶比天然酶保存的时间更长。 最适温度：(1) 固相酶的最适温度一般比天然酶高，个别会有所降低 (2) 同种酶，采用不同的方法或不同载体固定化后，其最适温度可能不同 最适pH：酶经固定化后，其作用的最适pH常会发生偏移，影响固定化酶最适PH的因素主要有两个: (1) 载体性质对最适pH影响(2) 产物性质对最适pH影响 载体性质对最适pH影响：用带负电荷载体制备的固定化酶，最适pH比游离酶最适pH高。用带正电荷载体制备的固定化酶，最适pH比游离酶最适pH低。用不带电荷载体制备的固定化酶，最适pH一般不改变。 影响的原因：因为固相酶颗粒在水溶液中，是被一层几乎不流动的液体包围着，这层不流动液体叫做扩散层，扩散层与其周围外部溶液之间存在着杜南（Donnan）平衡效应，即