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酶联免疫检测试剂盒及在三聚氰胺检测中的 基本原理及操作技术培训资料 酶联免疫检测试剂盒基本原理及操作技术培训资料 基本理论 1、酶联免疫吸附测定法（ELISA）简介 1.1、基本概念： 抗原：抗原是指进入人或动物机体后，可刺激机体免疫系统发生免疫应答，从而引起动物产生抗体或形成致敏淋巴细胞，并能和抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质。 抗体：是由抗原刺激动物的免疫系统后，由免疫系统产生分泌的能和相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。 抗原抗体的基本特性：a、反应的特异性；b、反应的等比例性 1.2、ELISA方法简介： ELISA属于标记免疫学技术的一种，1971年由荷兰和瑞典的学者提出，由于其操作过程简单易行并可以定量，从而使其在食品安全和卫生检测中得到了广泛的应用。目前市场上有多种基于ELISA方法开发的用于食品中抗生素检测的试剂盒产品。 1.3、ELISA方法的原理 基于抗原抗体反应的特异性和等比例性，以96孔的聚苯乙烯塑料微孔板（又称酶标板）为载体，在适当的技术条件下使抗原或抗体包被（吸附）在酶标板微孔的内壁上成为所谓的包被（固相）抗体或抗原，没有被吸附（游离）的抗原或抗体通过洗涤除去，然后直接加入酶标记抗体或抗原（或先加入适当的抗体或抗原与包被抗原或抗体反应后，再加入相应的酶标记抗体或抗原），形成酶标记的抗原—抗体复合物固定在微孔内，没有吸附的酶标记物洗涤去除，加入底物溶液于微孔中，复合物上的酶催化底物使其水解、氧化或还原成为有色的底物。在一定的条件下，复合物上酶的量（也反映了固定化的抗原抗体复合物的量）和酶产物呈现的色泽成正比，因此可以用分光光度计进行测定，从而计算出参与反应的抗原和抗体的量。这就是ELISA的原理。 1.4、ELISA方法的分类 ELISA可以分为直接法、间接法和夹心法等几种。 直接法： 直接法是指酶标抗原或抗体直接与包被在酶标板上的抗体或抗原结合形成酶标抗原—抗体复合物，加入酶反应底物，测定产物的吸光值，计算出包被在酶标上的抗体或抗原的量。见图2-17（a） 间接法： 是将酶标记在二抗上，当抗体（一抗）和包被在酶标板的抗原结合形成复合后，再以酶标二抗和复合物结合，通过测定酶反应产物的颜色可以（间接）反应一抗和抗原的结合情况，进而计算出抗原或抗体的量。见图2-17（b） 夹心法： 是先将未标记的抗体包被在酶标板上，用于捕获抗原，在用酶标的抗体与抗原反应形成抗体-抗原-酶标抗体复合物；也可以象间接法一样应用酶标二抗和抗体-抗原-抗体复合物结合，形成抗体-抗原-抗体-酶标二抗复合物，见图2-17（C）。前者称为直接夹心法，后者称为间接夹心法。 上述三种方法又可以分为竞争法和非竞争法。由于目前市面上的试剂盒产品绝大部分属于直接法中的竞争法。下面对直接法中的酶标抗原竞争法作重点说明。 在进行测定时首先将包被了抗体的酶标板的微孔分为测定孔和对照孔，在对照孔中加入系列标准品溶液和酶标记物；在测定孔中同时加入酶标记物和非酶标抗原（通常来自于待测样品），酶标记物和样品互相竞争包被抗体的结合点，经过温浴后，没有结合到包被抗体上的酶标记物和样品经过洗涤去除。拍干后加入底物溶液，经温育后洗涤拍干，显色、终止，用酶标仪测定吸光度值。其反应原理如（图2-18） 所获得的每个浓度标准溶液或样本吸光度值的平均值（B ）除以第一个标准（O 标准）的吸光度值（B 。）再乘以100 % ，即百分吸光度值。 百分吸光度值（% ) = ( B / BO ) / 100 % 公式中B 为样本溶液的平均吸光度值，B0为0PPb标准溶液的平均吸光度值。以克伦特罗浓度的半对数值为x 轴，百分吸光度值为Y 轴，绘制标准曲线图，（标准曲线如图一）相对应每一个样品中残留的克伦特罗的浓度可以从标准曲线上读出，在实际的计算中只需用酶标测出标准品和样品的吸光值，其他过程可通过专用的计算软件完成。 2、ELISA试剂的组成 2.1、完整的ELISA试剂盒应包含以下各组分：（1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂，俗称酶标板）；（2）酶标记的抗原或抗体（酶标记物）；（3）酶的底物；（4）系列参考标准品（定量测定）；（5）酶标记物及样本的稀释液；（6）洗涤液；（7）反应终止液。 2.2、ELISA试剂的作用 2.2.1、固相载体： 固相载体在ELISA测定过程中作为吸附剂和容器，不参与化学反应。可作ELISA中载体的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。ELISA载体的形状主要有三种：微量滴定板、小珠和小试管。以微量滴定板最为常用，专用于EILSA的产品称为ELISA板，国际上标准的微量滴定板为8×12的96孔式。 2.2、免疫吸附剂： 已包被抗原或抗体的固相载体，是ELISA方法中的核心试剂。 2.3、酶标记物： 即酶标记的抗原或抗体，是E