DB14／T1177—2016大田转基因棉花外源序列PCR检测规程.docVIP

ICS65.020.20 B 05 DB14 山西省地方标准 DB 14/T 1177—2016 大田转基因棉花外源序列PCR检测规程 2016 - 03 - 30发布 2016 - 05 - 30实施 山西省质量技术监督局 目次 前言 II 1　范围 1 2　规范性引用文件 1 3　术语和定义 1 4　试剂仪器材料 2 5　样品DNA提取 2 6　PCR 4 7　PCR 4 8　样品分析结果 5 9　检测档案记录 5 附录A（规范性附录）　 6 附录B（资料性附录）　 7 前言 本标准按照GB/T1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由山西省农业科学院提出并归口。 本标准起草单位：山西省农业科学院棉花研究所、运城学院、山西三联现代种业科技有限公司。 本标准主要起草人：马燕斌、张树伟、王霞、王新胜、吴霞、李燕娥、张相斌、杨帆、邵新胜、 韩青龙、马纪农。 大田转基因棉花外源序列PCR检测规程 范围 本标准规定了大田转基因棉花外源序列PCR检测的术语和定义、试剂仪器材料、样品DNA提取、PCR检测基因及序列、PCR反应程序及电泳检测、样品分析结果以及检测档案记录。 本标准适用于大田种植的山西省审定棉花品种中转外源序列相关成份的检测鉴定。 GB 4407.1 经济作物种子 第1部分：纤维类 NY/T 672 转基因植物及其产品检测 通用要求 NY/T 673 转基因植物及其产品检测 抽样 NY/T 1297 农作物品种审定规范 棉花 NY/T 2162 棉花抗棉铃虫性鉴定方法 术语和定义 下列术语和定义适用于本。棉花自然遗传存在的基因组序列除外包含有经基因序列通过技术手段基因组变化棉花植株、棉花种子及作为亲本遗传产生的后代。 棉花自然遗传进化存在的基因除外棉花自然遗传进化存在的基因组核苷酸序列除外组核苷酸组核苷酸序列Stearoyl-acyl carrier protein desaturase英文的缩写，指棉花自然遗传存在的基因序列编码棉花硬脂-酰基载体蛋白脱饱和酶的基因。 Polymerase Chain Reaction英文的缩写，即聚合酶链式反应；是一种基于DNA双螺旋分子的特点，利用核苷酸扩增仪通过一个包括DNA序列变性、退火引物与模板链结合、目标序列延伸的不断循环的过程来特定扩增目标DNA片段的分子生物学技术。 DNA提取及电泳常规用试剂 葡萄糖、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、β-巯基乙醇、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、盐酸（Hcl）、琼脂糖 PCR扩增常规试剂 Taq酶、dNTP、loading buffer 电子称、移液枪、高速离心机、水浴锅、PCR仪、电泳仪、凝胶成像仪、振荡器 1 mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（pH8.0） 称取121.1 g三羟甲基氨基甲烷溶解于800 mL纯净水中，用浓盐酸溶液调pH至8.0，用纯净水定容至1000 mL，在103.4 kPa、121 ℃条件下，灭菌15 min，常温储存备用。 0.5 mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液（pH8.0） 称取18.61 g 乙二胺四乙酸二钠溶解于800 mL纯净水中，用NaOH调节pH值至8.0，用纯净水定容至1000 mL，在103.4 kPa、121 ℃条件下，灭菌15 min，常温储存备用。 10%聚乙烯吡咯烷酮溶液 称取100 g聚乙烯吡咯烷酮溶解于800 mL纯净水中，定容至1000 mL，在103.4 kPa、121 ℃条件下，灭菌15 min，常温储存备用。 DNA提取缓冲液 称取69.36 g葡萄糖于1 L烧杯，加500 mL纯净水，充分溶解后，加入100 mL 1 mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液，10 mL 0.5 mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液，200 mL10%聚乙烯吡咯烷酮溶液，10 mLβ-巯基乙醇，充分混匀，用纯净水定容至1000 mL，在103.4 kPa、121 ℃条件下，灭菌15 min，常温储存备用。 棉花裂解缓冲液配方 1mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（pH8.0） 称取121.1 g三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶解于800 mL纯净水中，用浓盐酸溶液调pH至8.0，用纯净水定容至1000 mL，在103.4 kPa、121 ℃条件下，灭菌15 min，常温储存备用。 0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液（pH8.0） 称取18.61 g乙二胺四乙酸二钠溶解于800 mL纯净水中，用NaOH调节pH至8.0，用纯净水定容至1000 mL，在103.4 kPa、121 ℃条件下，灭菌15 min，常温储存备用。 10%十六烷基三甲基溴化铵溶液称取100 g十六烷基三甲基溴化铵，溶解于800 mL纯净水，加热促进溶解，加