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封闭 封闭(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。 封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥ELISA后续步骤中干扰物质的再吸附。 常用封闭剂：0.05%-0.5%的BSA; 10%的小牛血清或1%明胶;脱脂奶粉,可以高浓度使用（5%）。 结合物 结合物是酶标记的抗体（或抗原），即有酶的催化活性，也有抗体（或抗原）的免疫活性，还要有良好的稳定性。 制备结合物时，抗原或抗体在与酶联结时，为避免有其他杂蛋白的干扰，最好用层析纯化的抗体，使全部酶结合物均具有特异的免疫活性，可以在高稀释度进行反应，而不加深实验结果本底。 在ELISA中用酶标抗原的模式不多，总的要求是抗原必须是高纯度的。 酶 纯度高，催化反应的转化率高，专一性强，性质稳定，价格不贵，受检标本中不存在相同的酶。 酶结合物保留活性部分和催化能力，底物易于制备和保存，价格低廉，有色产物易于测定等。 在ELISA中常用的酶有：HRP，碱性磷酸酶AP，葡萄糖氧化酶，β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。 各位同学大家好，今天由我代表免疫室给大家讲解ELISA的原理及其应用 我主要从以下五方面为大家讲解 ELISA反应的基础原理就是，抗原抗体的反应，而这一反应主要有一下五个特征，1、特异性，抗原抗体的的化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。2、可逆性，抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡。解离后的的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性。3、4化学比色法的敏感度为mg/ml水平，酶反应测定法的敏感度约为5~10 μg/ml，酶标记的免疫测定的敏感度为ng/ml水平 在恒定量的抗体中加入递增量的抗原可以形成抗体复合物。该反应曲线的高峰部分是抗原抗体比例最合适的范围，称为等价带。在等价带前后分别为抗体过剩带和抗原过剩带。即出现假阳性或假阴性。 本法只适用于二价或二价以上大分子抗原，而不能用于测定半抗原等小分子物质。 复合物的形成量与待测抗原含量成正比 此间接结合在固相上的抗原远离载体表面，其抗原决定簇也得以充分暴露。 间接包被的抗原经固相抗体的亲和层析作用，包被在固相上的抗原纯度大大提高，因此含杂质较多的抗原也可采用捕获包被法，试验的特异性、敏感性均由此得以改善，重复性亦佳。间接包被的另一优点是抗原用量少，仅为直接包被的1/10乃至于/100。 主要用于测定血清中某种抗体亚成分，以目前最常用的IgM测定为例 此法既可用于检测抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体显色程度与待测物含量成反比。 封闭是否必要， 取决于ELISA模式及具体的实验条件。并非所有的ELISA均需封闭，封闭不当反而会使阴性OD增高。 一般说来，双抗体夹心法，只要酶标记物是高活性的，操作时洗涤彻底，不经封闭也可得到满意的结果。特别是用单抗腹水直接包被时，因其中大量非抗体蛋白在包被时同样也吸附在固相表面，业已起到了类似封闭剂的作用。 但在间接法测定中，封闭一般是不可少的。 ELISA 原理及应用 1.ELISA的原理 2.ELISA的类型 3.试剂准备 4.对照设定 5.结果判断 ELISA是一类常用的免疫酶技术。是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相表面进行 。 结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性。 酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留其酶的活性。 1.ELISA原理 抗原抗体反应的特点 特异性 可逆性 最适比例 敏感度 2.ELISA类型 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂： （1）固相抗原或抗体，即“免疫吸附剂”； （2）酶标记抗原或抗体，称为“结合物”； （3）酶反应的底物。 ELISA类型 1.双抗体夹心法 2.双抗原夹心法 3.间接法 4.捕捉法 5.竞争法 双抗体夹心法示意图 固相载体 抗体 抗原 酶 抗体 酶标记抗体 1.将抗体包被在固相载体上。 2.如样品中含有抗原，则结合 为抗原抗体复合物。 3.再加入酶标记抗体，则结合 为抗体-抗原-酶标记抗体复合 物。 4.酶催化底物并显色。 双抗原夹心法示意图 1.将抗原包被在固相载体上。 2.如样品中含有抗体，则结合 为抗原抗体复合物。 3.再加入酶标记抗原，则结合 为抗原-抗体-酶标记抗原复合 物。 4.酶催化底物并显色。 酶 抗原 酶标记 抗原 抗体 抗原 固相载体 酶 抗抗体 酶标记 抗抗体 抗体 抗原 固相载体 1.将抗原包被在固相载体上。 2.如样品中含有抗体，则结合 为抗原抗体复合物。 3.再加入酶标记抗抗体，则结合为抗原-抗体-酶标记抗抗体复合物。 4.酶催化底物并显色。 间接法示意图 捕捉法示意图 酶 抗体 酶标记 抗体 抗原 抗抗体 固相载体 抗体 1.将抗抗体包被在