Nucleosteminembryonicstemcellsandpromotesreprogrammingofsomaticcellstopluripotency翻译教程.docx

文章：Nucleostemin maintains self-renewal of embryonic?stem cells and promotes reprogramming of somatic?cells to pluripotency 杂志：J. Cell Biol.??? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 影响因子：10.822? 核干细胞因子维持胚胎干细胞的自我更新能力并促进体细胞的多能性重编程 核干细胞因子是核仁的GTP结合蛋白，在神经干细胞中首次发现，功能不明。本研究中，我们报导核干细胞因子在以下过程中必需，包括小鼠细胞胚胎发育到囊胚，维持胚胎干细胞(ESC) 自我更新，乳腺上皮细胞(MEC) 重编程为诱导多能干细胞(iPS) 。外源性NS还与Oct4和Sox2共同作用将MEC细胞和小鼠胚胎成纤维细胞重编程为iPS细胞。NS通过支持细胞快速经过G1期维持ESC的自我更新能力。胚胎干细胞中NS的敲除阻碍细胞通过G1期，诱导基因表达及形态的变化，其机制涉及只在延长的G1期活跃的MEK/ERK蛋白激酶。阻碍细胞周期抑制剂的作用能减轻这些影响。我们的研究结果暗示NS维持ESC的自我更新，凸显出该过程中细胞快速通过G1期的重要性，并增加了已知的重编程因子的种类。 前言 核干细胞因子基因(NS，或Gnl3) 在筛选神经干细胞优先表达基因的过程中发现(Tsai and McKay，2002) 。NS编码一个GTP结合蛋白(NS) ，主要存在于细胞核(Tsai and McKay，2002) ，但显然可以来回穿梭于核质中，对各种信号做出响应(Mengetal., 2008) 。NS的生物学功能还未研究清楚。尤其是不知这种蛋白是否在干细胞中扮演特定的角色。本研究试图确定NS在胚胎干细胞(ESCs) 的产生和维持中的作用。为此，我们在NS缺失的情况下，对早期胚胎发育进行了详细的检测，体外敲除胚胎干细胞的NS，测试NS在体细胞重编程到iPS细胞过程中的作用。结果表明NS对维持ESC自我更新过程有贡献，提出了NS可能支持自我更新的机制，显示快速通过G1期对保存胚胎干细胞自我更新能力的重要性，扩展了已知的重编程因子的种类。 结果 NS是桑椹胚发育到囊胚所必需的 我们建立了NS表达为零的小鼠系，使用的胚胎干细胞克隆有一个特征明显的基因陷阱插入物，在NS调节元件控制下转而表达半乳糖苷酶(β-gal) (图.S1A) 。我们通过分析插入的基因陷阱的分布(图.S1B) 、NS蛋白在杂合胚表达的效果和纯合胚Ns RNA的检测(图.S1C) 确认不表达NS的基因型(图.S1D) 。用β-Gal活性作为NS基因表达的替代指标，早在双细胞的胚胎期就能检测到其微弱表达，桑椹胚和囊胚表达强烈(图.1A) 。NS在双细胞胚胎的表达还通过实时定量PCR检测(qPCR) (数据未公布) 。与以前的报告一致(Beekman et al., 2006; Zhu et al., 2006) ) ，NS纯合性缺失小鼠(Nsβgeo/βgeo，即Ns-/-) 在胚胎发育早期死亡(图.S1E) 。 为了充分理解NS-/-胚胎致死的原因，我们评估了NS+/-杂交所得的植入前胚胎。E3.5阶段的NS+/-和NS+/+胚胎囊泡里有可辨别的内生细胞团(ICM) ，滋养外胚层(TE) 和囊胚腔(图.1B) 。相反，E3.5 NS-/-胚胎发育延迟，类似桑椹胚，并表现出不同程度的形态退化(图.1B) 。我们通过体外培养这些胚胎扩大了观察。2、4细胞期分离的NS-/-胚胎可发育到致密化过程，但随后退化没有形成胚囊(图.1C) 。同窝野生型发育正常(图.1C) 。在E3.5胚胎培养过程中，我们发现，NS-/-突变体也逐渐退化，没有类似ICM或TE结构的形成(Fig.1D) 。另外，BrdU掺入和TUNEL染色显示E3.5阶段NS-/-胚胎增殖减少并伴随凋亡增加(分别为图.1E和F) ，NS-/-胚胎没有发育到囊胚，随后死亡。综上，这些数据表明NS-/-胚胎的早期死亡可以归因于桑椹胚未能活过致密化阶段。NS杂合胚胎与野生对照无差别(图.S1，F–I) ，杂合小鼠表型正常可以生育(数据未公布) 。我们的观察与以前的一则报道相符，NS纯合缺失的小鼠在囊胚形成前中止胚胎发育。 NS是维持ESC自我更新必需的 接下来我们研究NS在胚胎干细胞中的作用。因为无法从NS-/-小鼠得到ICM期或之后的细胞，我们先用RNA干扰方法敲除NS，而后研究了小鼠胚胎干细胞的变化。我们测试了10个不同的短发夹RNA(shRNA) 结构或小干扰RNA的寡核苷酸，针对NS不同的转录区域。一个shRNA(shRNA1) 将NS蛋白表达降低到wes