构建RFP在宿主中的表达载体并表达蛋白教程.pptx

《现代生物实验技术原理与技术》学生研讨展示第三小组2016-12-4已有一原核表达载体pCR2.1、RFP蛋白编码基因、以及真核表达宿主Lentinusedodes，构建RFP在宿主中的表达载体并表达蛋白。课题实验思路cutlinkTargetSequenceOriginVectorVectorHostHosttransfectProteindetected方案流程查找载体、宿主信息查找基因序列表达载体筛选载体转染宿主构建表达载体设计扩增引物转染结果筛选蛋白表达检测查找载体信息pCR2.1TOPOTA载体查找宿主信息香菇（Lentinusedodes）是一种重要的药食两用真菌，产量仅次于双孢菇。1998年，Sato等以香菇原生质体为材料用限制性酶介导法首次成功转化香菇，将外源基因组整合到香菇的基因组中。2001年，孙丽等采用PEG(polyethyleneglycol,聚乙二醇)介导法在我国首次建立了香菇遗传转化体系。2008年，Kuo等建立了香菇电击法遗传转化体系。2009年，喻义赣等建立了香菇根癌农杆菌介导的遗传转化研究体系。RFP基因序列查找Addgene红色荧光蛋白(Red Fluorecent Protein,RFP)基因是从海葵Discoso-masp中分离出的一种新的荧光蛋白基因,其蛋白质的最大吸收光谱为583 nm，不需要任何预处理便可检测到。红色荧光蛋白因其红荧光较强的组织穿透力，已被广泛用于动物、植物和酵母等真核细胞内基因表达的报告基因。启动子序列查找题目要求网络搜索L.edodesbeta-肌动蛋白启动子和终止子，但我们没能检索到任何信息，故改用其他启动子。在香菇中较为常用的启动子主要有两种：ras基因的启动子和gpd基因的启动子。我们选用了香菇自身的gdp强启动子，因为相比ras，gpd能更有效地驱动外源基因的表达。根据己发表的香菇gpd启动子序列(郭丽琼等2007)，选择活性最强的Lgpd1启动子，并相应设计引物。潮霉素抗性基因序列查找通过网络搜索我们获知：在piggyBac-IRES-Hygromycin等质粒载体中都含有潮霉素抗性基因可通过购买或索取质粒以获取HPH序列。插入潮霉素抗性基因原因：在转染完成后，利用潮霉素培养基培养，筛选阳性重组子。因为外源DNA整合到染色体中概率很小，有报道表明大约1/104转染细胞能整合，因此通常需要通过一些选择性标记，如潮霉素B磷酸转移酶（HPH）、氨丙基转移酶（APH，新霉素抗性基因）等。M13F:5’TGTAAAACGACGGCCAGTM13R:5’CAGGAAACAGCTATGACCPF:5‘CTTCGCATAGCGGGATCATAPR:5’GTTCCCTATTATTGAGATCTTCATAGAAACAGTCGGCTCCTCAAGRFPF:5‘CTTGAGGAGCCGACTGTTTCTATGAAGATCTCAATAATAGGGAACRFPR:5’CCCCTGACGAGCATCACAAAATTAATCAGGAATCCCTAGTATTTTTAHPHF:5’CCGCTCGAGATGAAAAAGCCTGAACTCACCG(Xhol)HPFR:5’GCTCTAGACTATTCCTTTGCCCTCGGAC(Xbal)引物设计合成M13RM13FPRPFRFPRHPHFHPHRRFPFXholXbalM13F与M13R为载体上的保守序列引物，后期用于鉴定准备工作1、获取各基因序列来源材料包括V22CS2+RFPce（RFP来源）、香菇基因组（Lgfp1启动子来源）、piggyBac-IRES-Hygromycin（潮霉素抗性基因来源）2、获取连接、转化、胶回收用试剂（盒）3、引物合成（见前页）4、其他基本仪器及材料试剂串联原件准备用重叠PCR方法，使用两对引物（PF/PR和RFPF/RFPR）扩增出包含启动子序列和RFP基因序列的拼接序列。（先使用pfu酶扩增，再使用Taq酶处理扩增产物，在两端添加A）用HPH扩增引物（HPHF/HPHR）在其载体质粒（piggyBac-IRES-Hygromycin）中扩增出两端分别添加了XhoI和XbaI酶切位点的片段。串联原件构建载体1、TA连接（启动子+RFP基因）2、酶切连接（IRES-hygromycin-终止子序列片段）IRES是内部核糖体进入位点序列（Internalribosomeentrysite,IRES）能招募核糖体，继续翻译Hygromycin。串联原件构建载体将pCR2.1载体、重叠PCR扩增所得目的基因片段按试剂盒所给体系进行连接。连接产物中即包含了成功将【启动子+RFP基因】元件插入pCR2.1载体的成分。再通过下一步的筛选可以得到阳性的质粒载体。1.TA连接TA连接筛选验证将TA连接反应产物转化感受态细