第三章 核酸的分离与检测.pptVIP

实验步骤 6、按以下混合好样品（以下为参考值，可视实际样品作调节）。①2 微升样品A，2微升加样缓冲液，10 微升电泳缓冲液。②2 微升样品B，2微升加样缓冲液，10 微升电泳缓冲液。③2 微升样品C，2微升加样缓冲液，10 微升电泳缓冲液。7、在玻片上各把上述样品混合均匀，用微量取液器分别吸取样品，小心将样品注入点样孔内，记录样品的点样顺序。8、点样孔那端的电泳槽负极连接电泳仪负极，另一端连接电泳仪正极，打开电泳仪电源开关（每次打开电源开关时，应检查电压旋扭是否置于零位），调电压至5v/cm（以水平大电泳槽的两极算距离）。9、待溴酚兰带走入凝胶6 厘米后，小心取出微型电泳槽，勿使凝胶滑出，置于保鲜纸上，放在紫外检测仪上，打开紫外灯，观察电泳结果，绘好DNA区带电泳图。 【注意事项】 1.?溴化乙啶是一种强诱变剂，并有中度毒性，取用含有这一染料的溶液时务必戴手套。 2.?紫外线对人体，尤其是眼睛有危害性。为减少紫外线照射，必须确保紫外线光源受到遮蔽。 基因工程：第三章 Questions 核酸提取的原则和要求？ 核酸提取的一般步骤？ 核酸提取的常用方法有哪些？ 核酸提取过程中SDS、CTAB、EDTA有何作用？ 核酸提取过程中乙醇（无水和70%）有何作用？ 如何除蛋白？ 如何破细胞？在破细胞时需要注意哪些事项？ 如何防止内源性核酸酶对核酸的损失？ 检测核酸浓度和纯度的方法有哪些？基本原理？ 基因工程：第三章 保证完整性：保证核酸分子的一级结构（储存全部遗传信息） * 样品准备： 1、动物材料：清洗-胰酶消化 2、植物材料：清洗-液氮冻结 物理法：超声波法、匀浆法、液氮破碎法、研磨法（动植物细胞） 化学法：去污剂法（SDS法、CTAB法） 酶法：蛋白酶k、溶菌酶 影响因素：金属离子、60° * 由于高等动物DNA 主要存在于细胞核与线粒体中，所以提取时有两个困难（高等植物与此类似）：????????? ①破碎细胞难；从处死动物分离组织器宫到破碎细胞费时长。在此时期间DNA 可能会被DNase降解，而动物组织：特别是肌肉组织很难破碎,即使是较易破碎的肝?肾等组织也往往使用组织匀浆器，易造成DNA 断裂。?????????? ②分子量大，一般比细菌的大2—3个数量级，比病毒的大4—5个数量。对不同生物材料，要根据具体情况选择适当的分离提取方法。以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂 * 动物细胞和植物细胞的结构区别主要有四个：细胞壁、液泡、叶绿体和中心体，其中细胞壁、液泡、叶绿体植物细胞有，动物细胞没有，中心体动物细胞和低等植物细胞有，高等植物细胞没有，液泡只在成熟植物细胞中明显，叶绿体只存在于植物的绿色部位，所以动、植物细胞最本质的区别是细胞壁。而微生物是一个泛称，不是一个分类单位，包括病毒、原核生物、原生生物和真菌四大类，病毒无细胞结构，原生生物和真菌是真核生物，所以原核细胞结构与真核细胞结构的最大区别是原核细胞无成形的（即由核膜包被的）细胞核，另外原核细胞无核仁和染色体，只有核糖体，无其它细胞器。 * 基本上，核酸在保存中的稳定性，与温度成反比，与浓度成正比。 * * 文库：可以从基因文库当中获取目的DNA或者人工合成。 方法：Southern blotting, Northern blotting, hybridization in situ, probe。 * ?核酸和蛋白质在生物体中常以核蛋白(DNP/RNP)形式存在，其中DNP能溶于水及高浓度盐溶液，但在0.14mol/l的盐溶液中溶解度很低，而 RNP则可溶于低盐溶液，因此可利用不同浓度的NaCl溶液将其从样品中分别抽提出来。 ?将抽提得到的DNP用SDS处理可将其分离成DNA和蛋白质，用氯仿-异戊醇将蛋白质沉淀除去可得DNA上清，加入冷乙醇即可将其呈纤维状析出。 利用RNP和DNP在电解溶液中溶解度不同，将二者分离，常用的方法是用1M 氯化钠提取氯化钠抽提,得到的DNP粘液与含有少量辛醇的氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中,用2倍体积95%乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来.? 也可用0.15 MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNP,再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿---异醇法除去蛋白.　　两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些。? 以稀盐酸溶液提取DNA 时,加入适量去污剂,如SDS可有助于蛋白质与DNA 的分离。在提取过程中为抑制组织中的DNase对DNA 的降解作用,在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂.通常用0.15MNaCL,0.015M柠檬钠,并称SSC溶液,提取DNA. * ? 利用RNP和DNP在电解溶液中溶解度