组织工程与干细胞研究所实验方法要点.docVIP

组织工程与干细胞研究所常用实验方法指南 目 录 实验一 总RNA的提取（Trizol法提取） 1 实验二 RT-PCR 2 实验三 iCycler 荧光定量PCR 4 实验四 琼脂糖核酸电泳 9 实验五 大肠杆菌质粒DNA的提取（碱裂解法） 10 实验六 感受态细胞的制备 14 实验七 酶 切 15 实验八 连 接 16 实验九 转 化 16 试验十 重组子的筛选和鉴定 17 实验十一 重组腺病毒构建，扩增及纯化基本技术操作 18 实验十二 细胞培养一般方法 25 实验十三 小鼠胚胎干细胞（iPS干细胞）的培养 27 实验十四 小鼠iPS干细胞的诱导 29 实验十五 关节软骨细胞的原代培养 28 实验十六 脂肪干细胞的原代培养 28 实验十七 人髓核细胞的培养 29 实验十八 大鼠椎间盘整体培养 30 实验十九 iPS干细胞诱导为软骨细胞（髓核细胞）的培养 33 实验廿sGAG测定 34 实验廿一DNA测定（参照Hoechst 33258说明书） 35 实验廿二 胶原含量测定（参照羟脯氨基酸试剂盒说明书） 37 实验廿三 胶原提取 38 实验廿四 关节软骨缺损模型的制作 39 实验廿五 兔椎间盘退行性变模型的制作 37 实验廿六 大鼠急性心肌梗死模型的建立 38 实验廿七 TUNEL法检测细胞凋亡 43 实验廿八 流式细胞仪检测细胞凋亡 46 实验廿九 CCK8细胞增殖实验和细胞毒性检测 46 实验卅 核型分析 47 实验卅一 碱性磷酸酶染色 47 实验卅二 组织病理技术 48 实验卅三 番红-快绿染色 47 实验卅四 甲苯胺蓝染色 48 实验卅五 免疫组化染色 49 实验卅六Western Blot 54 实验卅七PPCLM/BMG椎间盘双相支架的制备 63 附录 分子生物学常用溶液配制 65 实验一 总RNA的提取Trizol法提取在收集到生物材料之后，最好能即刻进行RNA制备工作。若需暂时储存，则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80℃冷冻柜。在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。 提取组织RNA时，每50-100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行裂解；提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5-10106个细胞加1ml Trizol后，反复用枪吹打以裂解细胞； 将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中，在室温（15℃-30℃）下放置5分钟； 在上述EP管中，按照每1ml TRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下（15℃-30℃）放置2-3分钟后，12000g（2℃-8℃）离心15分钟； 取上层水相置于新EP管中，按照每1ml TRIZOL加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下（15℃-30℃）放置10分钟， 12000g（2℃-8℃）离心10分钟； 弃上清，按照每1ml TRIZOL加1ml 75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g（2℃-8℃）离心5分钟，弃上清； 让沉淀的RNA在室温下自然干燥； 用Rnase-free water 溶解RNA沉淀μl)。RT-PCR Protocol: Fermentas Two Step RNA PCR Kit 1. cDNA的合成 本实验室内采用Fermentas 两步法PCR试剂盒，本试剂盒保证性一般，仅用于基因表达的检测等按下列组成在PCR反应管中调制反应液Reagent Quantity, for 20μlof reaction mixture Template RNA（μg Total RNA） 5μl oligo(dT)18Primer or random hexamer primer 1μl DEPC-treated dH2O to 12μl 5×Reaction Buffer 4μl RNase Inhibitor (20U/μl) 1μl 10 mM dNTP mix 2μl Reverse Transcriptase(200U/μl) 1μl Total 20μl /Sample 反应总体积根据实际情况进行调控，可以做20-50μl以节约试剂； 将上表各成分加入到0.2ml或0.5ml灭菌的PCR薄壁管中； 按以下条件进行反应℃ 60min，70℃ 5min。如不立即进行后续实验反应产物储存于-80℃冷冻柜按下列组成在PCR反应管中调制反应液：Reagent Quantity, for 25μl of reaction mixture PCR MasteriskMix (2×) 12.5 μl 10μM Primer 上游 1 μl 1