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PCR法获取目的基因 农学112班 马晴晴 孙婷婷 张 娜 金漪倩 胡 斐 徐振鹏 PCR技术的定义及其发展历史 PCR技术的原理 PCR的反应体系和条件 PCR法获取目的基因 PCR技术的未来展望 PCR技术 多聚酶链式反应(Polymerase Chain Reaction) PCR技术即多聚酶链式反应，又称聚合酶链式反应。是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法。 在生物学实验中做为基础存在，可以说是现代分子生物学研究中最重要的技术。 一、PCR技术的创建 1.Khorana等1971年提出在体外经DNA变性、 与适当引物杂交、再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。 2.1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。 3.1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术。 4.1988年，第一台PCR仪问世。 5.1989年美国《Science》杂志比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。 二、 PCR技术的原理 1. PCR技术 在微量离心管中,加入适量的缓冲液, 微量的模板DNA,四种脱氧核苷酸,耐热性DNA聚合酶, 一对合成DNA的引物,通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段的循环合成DNA，每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍。一般样品经过30次循环,可使基因的拷贝数达到数百万。 PCR原理 （1）类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于寡核苷酸引物的存在 （3）重复“变性--退火--延伸”的循环，可获得大量的新DNA链，而且这种新链又可成为下次循环的模板，从而指数级地获得大量DNA产物，数小时内可使目的基因的数量扩增数百万倍。 （2）PCR过程：由变性—复性（退火）--延伸三个基本反应步骤构成 ①变性：94℃左右，使双链DNA模板解离成为单链； ②复性：55℃左右，引物与模板DNA单链互补配对结合； ③延伸：72℃左右，“模板-引物结合物”在DNA聚合酶作用下，以dNTP为原料，以靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成新的DNA链 2. PCR技术的特点 1）速度快，灵敏度高：经过30轮循环，理论上目的产物的 扩增量达230个拷贝（109拷贝）。 2）特异性：引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键；引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性，同时尽可能减少非特异性扩增。 3）操作简便易行：只需要数小时就可以用电泳法检出1μg基因组DNA中仅含数个拷贝的模板序列。 三、PCR的反应体系和基本步骤 H2O 35μL 10×PCR反应缓冲液 5μL 25mmol/L MgCl2 4μL 4种dNTP 4μL 上游引物（引物１） 0.5μL 下游引物（引物２） 0.5μL 模板DNA (约1ng) 0.5μL Taq酶 0.5μL 1 .反应体系组成成分（总体积：50 ?L） 模板DNA dNTP 引物 Buffer Mg2+ 预变性 模板DNA dNTP 引物 Buffer Mg2+ TaqDNA聚合酶 94℃ 5min 2. 基本程序 PCR排管 Taq 酶 模板DNA dNTP 引物 Buffer Mg2+ 循环仪 94℃ 55 ℃ 72 ℃ 72 ℃ 5～7 min 扩增出的目标基因 琼脂糖凝胶电泳 转移点样 进行电泳 扩增出的目的基因 3. PCR反应条件 循环参数 （1）预变性：94 ℃ 5 min （2）变性：94 ℃ 20 s-45 s 使双链DNA解链为单链 （3）退火：温度由引物的解链温度Tm决定，时间45 s左右。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合；降低温度 可增加反应的灵敏性。 （4）延伸：一般为72℃，时间由扩增片段长度决定。 （5）循环次数：主要取决于模板DN