5第六章工业微生物的诱变育种解说.pptVIP

* * 营养缺陷型（auxotroph）：是指丧失了合成一种或多种必需生长因子能力的菌株，它们只能在补充了相应的生长因子的培养基上才能正常生长。 野生型（wild type)：从自然界分离到的任何微生物在其发生营养缺陷突变前的原始菌株，均称该微生物的野生型。 原养型（prototroph) ：营养缺陷型突变株经回复突变或重组后产生的、其营养要求在表型上与野生型相同的菌株。 * 完全培养基 Complete Medium （CM）含有满足某微生物的所有营养缺陷型和野生型菌株生长所需营养物质的天然或半合成培养基。 基本培养基Minimal Medium（MM）：不含生长因子仅能满足某微生物的野生型菌株生长需要的最低成分合成培养基。 补充培养基Supplemented Medium(SM)：补充了一种或数种生长因子，以满足某微生物的特定的营养缺陷型生长的培养基，其中的生长因子多是通过直接添加AA、碱基或维生素而提供。 在筛选营养缺陷型菌株中，与之有关的培养基有三类： * 与营养要求有关的三种遗传型 基本培养基MM 完全培养基CM 或补充培养基MM+A、MM+B 野生型[A+B+] 原养型[A+B+] 营养缺陷型[A+B-]或[A-B+] 回复突变或重组 诱变 * 营养缺陷型突变株的应用 科研上： 研究代谢途径； 基因重组的遗传标记菌种； AA、碱基、维生素生物测定的试验菌种 生产上： 氨基酸，核苷酸等发酵产品生产菌种的代谢调控育种； 生产菌株杂交育种的亲本进行遗传标记 * （一）营养缺陷型菌株的分离和筛选 营养缺陷型菌株的筛选一般包括诱发突变、淘汰野生型菌株、检出缺陷型、鉴别缺陷种类等步骤。 1. 营养缺陷型的诱发 营养缺陷型的诱变方法和所用的诱变因子与普通诱变育种基本相同，只是由于营养缺陷型属于单一基因突变，各种诱变剂的功能不同，有的不宜作为营养缺陷型诱变剂。 例如：电离辐射易引起染色体巨大损伤，所产生的缺陷型菌株不能用作杂交育种和原生质体融合育种的亲本，否则其杂交后代所形成的杂合二倍体不易发生有丝分裂交换及单倍化，不利于重组体形成。 * 用于诱发营养缺陷型的诱变剂有亚硝基胍、紫外线、亚硝酸等。其中亚硝基胍诱发频率极高，一般可达10%以上。 后培养：在CM中进行，消除突变细胞的表型延迟（生理性延迟和分离延迟） 饥饿培养：洗涤后用无氮基本培养基培养4~6小时，避免在淘汰野生型时营养缺陷型被误杀 * 2. 淘汰野生型菌株 淘汰野生型：降低野生型细胞的数量和比例，使营养缺陷型细胞得以相对浓缩 ，以利于检出。 原理：限制营养成分使缺陷型细胞生长受抑制，野生型细胞在生长过程中被杀死或生长后被除去 方法： 差别杀菌：利用芽孢或孢子比营养细胞更耐热的特点。 将诱变处理的细菌形成芽孢，把芽孢在基本培养液中培养一段时间，然后加热杀死营养体。由于野生型芽孢能萌发所以被杀死，而营养缺陷型不能萌发不被杀死。 * 抗生素法： 常用于细菌和酵母菌营养缺陷型菌株的富集，前者用青霉素法，后者用制霉菌素法。 原理：细菌细胞壁的主要成分为肽聚糖类，而青霉素能抑制细胞壁肽聚糖链之间的交链，阻止合成完整的细胞壁。处在生长繁殖过程的细菌对青霉素十分敏感，因而被抑制或杀死，但不能抑制或杀死处于休止状态的细菌。 * 抗生素淘汰野生型的方法和步骤： （1）将诱变处理后的菌体用完全培养液振荡培养2—3代以 结束表型延迟现象，达到稳定的表型和生理状况。 （2）饥饿培养：培养细胞经离心、洗涤后，悬浮于无氮基本培养基中培养4-6小时，耗尽细胞内氮源，防止加抗生素后的“误杀”； （3）加抗生素处理：加入等体积的2N基本培养基（两倍浓度氮源的基本培养基），同时加入抗生素，培养一定时间，野生型细胞由于生长而被杀死，缺陷型细胞处于休止状态而得以保留。 （4）取样分别涂布MM和CM平板，菌落数差异大的浓缩效果较好。 * 制霉菌素可用于处理酵母菌和霉菌。 注意：培养基应添加渗透压稳定剂而制成高渗培养基，可避免由于细胞破裂而给缺陷型提供营养物质使其生长繁殖，最终也被青霉素破坏，造成缺陷型筛选率大为下降。 * 菌丝过滤法：适用于丝状真菌 将诱变后的孢子接种至MM中，控制培养时间，使野生型长成菌丝体，通过过滤而除去菌丝体，反复几次后，剩余的多为缺陷型孢子。 * 饥饿法 原理：微生物的某些缺陷型菌株在某些培养条件下会因代谢不平衡自行死亡，可是如果在细胞中发生了另一营养缺陷型突变，这一细胞反而会因代谢平衡的恢复而避免死亡，从而双重缺陷型突变株可被浓缩。 举例： 1）胸腺嘧啶缺陷型细菌在不加胸腺嘧啶时在短时间内细胞大量死亡。而残留下来的细菌中可以发现许多营养