第三基因载体的选择与构建质粒简介.ppt

作 业 1.致死效应、基因载体、报告基因、多克隆位点和表达载体的概念。 2.简要回答载体必须具备的条件。 3.什么是细菌质粒的不相容性？ 4.简述质粒的种类及类型，说明不同种类的质粒如何进行迁移作用。 5.如何对质粒进行人工改造，使其成为载体。 6.pBR322和pUC质粒的各组成部分的来源分别是什么？ 7.什么是穿梭质粒？ 具有较小的分子量和较高的拷贝数：可容纳外源DNA更长； 改造内切酶位点，具有若干限制酶切单一位点的多克隆位点（人工合成且密集排列）； 具有2种以上的选择标记基因； 无mob基因； 插入外源基因后，较易导入宿主菌内复制和表达，且不会因接触而转移到另一个细菌。 二、质粒载体的必备条件 多克隆位点 ori 复制起始点 遗传标记 Amp polylinker 克隆载体 作为载体的质粒都含有三种共同的组分： 复制子、选择性记号、克隆位点 多克隆位点：是指载体上人工合成的含有紧密排列的限制性内切酶酶切位点的DNA片段。 1、 天然质粒； 2、 pBR322质粒载体； 3、 pUC质粒载体； 4、 pGEM系列质粒； 5. 穿梭质粒； 三、常用的质粒载体 1.天然质粒 概念：没有经过以基因克隆为目标的体外修饰改造的质粒。 在大肠杆菌中，常见的可用于基因克隆的天然质粒有Col E1、RSF2124和pSC101等，但存在一定的局限性。 第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，它只含有一个EcoRⅠ酶切位点，一个四环素抗性选择记号（Tetr ）,插入外源片断后不影响其复制功能。 但该质粒分子量较大，拷贝数低只具有抗菌素抗性基因，无法使用插入失活技术选择重组分子。 ① pSC101 ColE 1质粒在其唯一的单切割位点EcoRⅠ中克隆外源DNA片断后，可根据对大肠杆菌素E1的免疫性选择转化子，不能合成大肠杆菌素E1的菌落是具有重组质粒的转化子。但对大肠杆菌素E1的免疫筛选，在化学上是相当麻烦的。 ② ColE 1 ③ RSF 2124 根据对氨苄青霉素的抗性表型选择转化子。 Col E1质粒载体 松弛型、多拷贝的质粒，能产生细菌素。细菌素对大肠杆菌的正常生命活动有抑制作用（复制、转录、转译及能量代谢等），但含有对细菌素的免疫基因。 细菌素：是一类特殊的蛋白质。通过同敏感细菌细胞壁的结合作用，而抑制一种或数种在细胞内进行的生命过程。 大肠杆菌素有多种类型，如B、E1、K、E2、E3，其抑制敏感细胞的作用方式不同。大肠杆菌素对于不带有相应Col质粒的敏感细胞有致死作用，而带有Col质粒的细胞对于基因所编码产生的大肠杆菌素是免疫的。 对免疫性标记的检测方法： 将产生大肠杆菌素E1的寄主细胞涂布在有敏感细菌长成的菌苔上，寄主细胞分泌出的大肠杆菌素E1会抑制周围敏感细胞的生长并使之致死→菌苔背景上出现空斑的清亮区 在EcoRⅠ位点上插入外源DNA，会使该基因失活，但其免疫性仍存在。免疫基因immE1可以作为质粒的选择记号。 用 ColE 1质粒特征为基础建立的转化细胞系，存在一定的缺陷性： ① 应用大肠杆菌素免疫作为标记操作上不方便； ② 在细菌群体中，能够以相当高的频率自发的产生出抗菌素的突变体细胞。 2.pBR322质粒载体 “P”表示是一种质粒； “BR”表示两位主要构建者姓氏的头一个字母 “F.Bilivar和R.L.Rodriguez”; “322”表示实验编号。 具有多抗药性的强选择记号、低分子量、高拷贝、外源基因插入后不影响该质粒复制功能的多种核酸内切限制酶单切割位点等特点。 ① pBR322主要组成部分的来源 亲本：pMB1和pSF2124; Ampr基因来源于pSF2124； Tetr基因来源于Psc101; 复制起点（ori）来源于Col E1。 Example: 在pBR322质粒的BamHⅠ或SalⅠ位点插入外源DNA片断，切断了tetr基因编码序列的连续性，使之失去活性，产生出AmprTets表型的重组pBR322质粒，转化入AmpsTets的大肠杆菌细胞。先涂布在含氨苄青霉素的选择培养基上，筛选出具Ampr菌落，再将它们涂布于含四环素的选择性培养基上。插入外源片断的重组质粒不能在这种培养基上生长。 ampr ② pBR322质粒载体的优点 A. 具有较小的分子量 它的分子量为4363bp。克