γδT细胞在呼吸道合胞病毒感染影响过敏性气道炎症反应中作用.pdfVIP

红细胞裂解液、胰酶、荧光标记单克隆抗体(PE．anti-TCR5 mAb；FITC．anti．CD69mAb)等。 RT-PCR试剂盒。 2、病毒的繁殖与滴定 法分离病毒，．80C冰箱保存。病毒滴度用组织细胞半数感染量(TCID50)表示。 3、实验性哮喘动物模型 动物：将购于中国科学院上海实验动物中心的SPF级6～8周龄雌性BALB／e 小鼠随机分为3组，每组8只，分别是实验组，包括致敏前RSV感染组(RSV他vA) 和致敏后RSV感染组(OⅥ诹SV)以及对照哮喘组(OVA)。 OVA和2．25 哮喘模型：dR-次腹腔注射O．1“含20Itgmg氢氧化铝的乳化 液致敏，二次注射间隔为2周。末次致敏后第14天，小鼠吸入超声雾化的l％OVA 生理盐水20分钟，每天1次，持续3天。末次雾化吸入后第2天收集标本。 RSV感染模式：病毒感染时间选择在初次致敏前第7天(致敏前RSV感染)和 106 RSV TCID50 末次致敏后第7天(致敏后RSV感染)。经鼻粘膜感染20lal含2x 的病毒悬液。 4、标本采集与检测方法 (1)肺组织病理标本制作及染色：取模型鼠左肺下叶，制备石蜡切片，常规 HE染色，光学显微镜观察肺组织形态结构及炎症反应情况。 (2)肺组织淋巴细胞的提取：水合氯醛深度麻醉小鼠，经心脏灌流去除血管 DNaseI的培养液消 内血细胞后取肺组织。用含有20099／ml胶原酶I和3099／ml 化处理肺组织，淋巴细胞分离液分离肺淋巴细胞。 PBS经支 (3)肺泡灌洗液(BALF)的收集及炎性细胞的分类与计数：用lml 气管冲洗肺组织，收集肺泡灌沈液。离心后取细胞悬液作涂片，瑞氏染色后显微 镜下随机选择视野，计数200个细胞，分别计数中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和巨 噬细胞数量。 2 OVA包被96孔 (4)ELISA法检测血清中过敏原特异性抗体含量：109tg／ml 板，4。C过夜后l％BSA封闭30分钟，加稀释的血清样本培养l小时后，分别加 波长读取OD值，从标准曲线获取血清抗体含量。 RNA提取试剂盒提取肺组织总RNA，采用Real-timeRT．PCR技术检测Thl型细 胞因子IFN吖和Th2型细胞因子IL．4的mRNA表达水平。 (6)脾细胞分离及其悬液制备：颈椎脱位处死小鼠，常规无菌制备脾细胞悬 液，调整细胞浓度至lxl06／ml。 (7)流式细胞仪检测脾和肺组织中活化的丫6T细胞数量：调整小鼠淋巴细 胞浓度至lx106／ml。加入PE标记的anti．TCR8 mAb或anti．CD69mAb，避光冰浴30分钟，冷的PBS洗涤两次，震荡混匀细胞 后上机检测。 T细胞回输实验：末次雾化吸入后第2天无菌分离OVA组小鼠脾淋 (8)V8 巴细胞，流式细胞分选仪分选PE．anti-TCR8 raAb标记的俩T细胞，用RPMI．1640 T细胞，2x104／鼠，细胞 调整细胞浓度为Ixl06／ml，从小鼠尾静脉回输分选的丫6 回输时间为初次雾化吸入前1小时。 (9)统计学分析：采用SPSSl6．0软件进行统计学分析，实验结果以X±S 表示，组问比较采用t检验分析。PO．05判定为有统计学意义。 实验结果 l、致敏前感染RSV减轻哮喘鼠肺炎症反应 经OVA致敏和激发的BALB／c鼠气道上皮增厚、管腔狭窄、肺组织内炎性细 胞总数和嗜酸性粒细胞、中性粒细胞