实验六植物组织基因组DNA的提取与分析(SDS法)分析.ppt

六、注意事项 （1）叶片磨得越细越好。 （2）移液器的使用。 （3）由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步（研磨）的操作应迅速。 * 实验六 植物组织中DNA的提取与分析（SDS法） 温馨提示：实验中-20℃冰浴时，请将样品放入6309室冰箱冷冻层。 * （1）掌握植物组织中DNA提取的原理和方法。 （2）掌握DNA的琼脂糖凝胶电泳检测方法 一、实验目的 二、实验原理 高浓度的SDS在EDTA存在下裂解细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸，PVP与多酚类物质结合形成复合物，离心除去沉淀后，上清液中的DNA用氯仿等抽提，反复抽提后用异丙醇沉淀水相中的DNA。 * 三、仪器和试剂 1、仪器： 高速离心机、水平电泳槽、电泳仪。 2、试剂： 抽提缓冲液（50mM Tris-HCl pH8.0、0.25M NaCl、20mM EDTA、0.5%SDS、2%PVP）、β-巯基乙醇、无水乙醇、氯仿:异戊醇（24:1）、异丙醇、70%乙醇、TE缓冲液、上样缓冲液（0.5%溴酚蓝+40%蔗糖）、1×TAE电泳缓冲液。 四、实验步骤 称取30mg植物幼苗放入研钵中 加入300ul抽提缓冲液+75ul无水乙醇+20ulβ巯基乙醇，充分研磨 匀浆液全部转入1.5ml离心管中 用200ul抽提缓冲液冲洗研钵，然后倒入离心管中 加入600ul氯仿:异戊醇，上下颠倒轻轻充分混匀，-20℃放置10min 12000r/min离心10min 上层水相移入另一新离心管 加600ul预冷的异丙醇，混匀后-20℃静止30min 12000r/min离心10min 弃上清，沉淀用600ul 70%乙醇漂洗 弃上清，加20μLTE溶解沉淀，即得DNA溶液 12000r/min离心10min 1、DNA的提取 * 四、实验步骤 2、DNA电泳检测 （1）1%琼脂糖凝胶：称取0.3g琼脂糖，加入30mL 1×TAE缓冲液，在微波炉中加热，反复加热、振荡2-3次，使琼脂糖充分融化。待凝胶冷却至60℃左右，倒入插入梳子的凝胶板中（避免产生气泡），让凝胶自然凝固。 （2）待凝胶凝固后，小心拔出梳子，避免前后左右摇晃，以免破坏胶面及加样孔，小心将凝胶和胶床放入电泳槽中，加样孔靠近阴极的一端。 * 四、实验步骤 2、DNA电泳检测 （3）上样电泳：将20μLDNA样品溶液和5μL上样缓冲液混匀后，上样，100V稳压电泳检查，根据指示剂迁移的位置，判断是否中止电泳。切断电源后，再取出凝胶。 （4）照胶、拍照：将凝胶泡在EB溶液（注意：EB溶液为剧毒物，需带上一次性手套拿取凝胶）中10min左右，进入暗室，使用凝胶成像系统照胶并拍照。 * 五、实验结果与分析 1 2 3 4 图1 植物组织基因组DNA提取结果 将凝胶图片打印出来，需要说明： 1、小组点样孔号； 2、DNA质量分析。