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普通高中课程标准实验 ——生物技术实践 专题2 微生物的培养和应用 课题1 微生物的实验室培养 课题2 土壤中分解尿素的细菌的 分离与计数 课题3 分解纤维素的微生物的分离 课题1 微生物的实验室培养 实验1-1 实验室常用的消毒和灭菌方法 实验1-2 制备牛肉膏蛋白胨固体培养基 实验1-3 纯化大肠杆菌 实验1-1 实验室常用的消毒和灭菌方法 高压蒸汽灭菌 一、目的要求 1.了解高压蒸汽灭菌的基本原理及应用范围。 2.学习高压蒸汽灭菌的操作方法。 二、基本原理 高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排汽阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点升高，得到高于100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。 在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压 ，所以，当水蒸气中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。 一般培养基用0.1MPa，121.5℃，15~30min可达到彻底灭菌的目的。灭菌的温度及维持的时间随灭菌物体的性质和容量等具体情况有所改变。 灭菌锅内留有不同分量空气时，压力与温度的关系 三、操作步骤 1. 将内层锅取出，再向外 层锅内加入适量的水使 水面与三角搁架相平为 宜。 2.放回内锅层，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免防碍蒸汽流通而影响灭菌效应，三角烧瓶与试管口端均不要与桶臂接触，以免冷蒸汽淋湿包口的纸而透入棉塞。 3. 加盖，并将盖上的排器软管插入内锅层的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致。勿使漏气。 4. 用煤气加热，待冷空气完全排尽后，关上排气阀。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实验用0.1MPa，121.5℃，20min灭菌。 5. 灭菌所需的时间到后，关闭煤气，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表降至“0时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。 6. 将取出的灭菌培养基放入37℃温箱培养24h，经检查若无杂菌生长，即可待用。 干热灭菌 将灭菌物品放入干热灭菌箱内，在160～170°C加热1～2h可达到灭菌的目的。能耐高温的、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿（吸管、培养皿）和金属用具等，可以采用这种方法灭菌。 灼烧灭菌 将微生物的接种工具，如接种环、接种针或其他金属工具，直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，可以迅速彻底地灭菌。此外，接种过程中，试管口或瓶口等容易被污染的部位，也可以通过火焰灼烧来灭菌。 除了以上方法外，实验室里还用紫外线或化学药物进行消毒。例如，接种室、接种箱或超净工作台在使用前，可以用紫外线照射30min，以杀死物体表面或空气中的微生物。在照射前，适量喷洒石碳酸或煤酚皂溶液等消毒液，可以加强消毒效果。 实验1-2 制备牛肉膏蛋白胨固体培养基 培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。 培养基的种类多 培养基一般应含有水分、碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子等。 霉菌和酵母菌的培养基的pH一般是偏酸性的，而细菌和放线菌的培养基的pH一般为中性或微碱性的。 一、目的要求 1．明确培养基的配制原理。 2．通过对牛肉膏蛋白胨培养基的配制，掌握 配制培养基的一般方法和步骤。 3．掌握倒平板的基本操作技术。 ? 二、基本原理 牛肉膏蛋白胨培养基中含有牛肉膏、蛋白胨和NaCl。其中牛肉膏为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素，而NaCl提供无机盐。在配制固体培养基时还要加入一定量的琼脂作为凝固剂，琼脂在96℃时溶化，40℃时凝固，通常不被微生物分解利用。 牛肉膏蛋白胨培养基的配方 牛肉膏 5.0g 蛋白胨 10.0 g NaCl 5.0 g 琼脂 20.0 g 水 1000 ml pH 7.4～7.6 三、实验器材 溶液或试剂 牛肉膏，蛋白胨，NaCl，琼脂，lmol/L NaOH lmol/L HCl。 仪器或其他用具 试管，三角瓶，烧杯，量筒，玻棒，天平，牛角匙，