蛋白质工程研讨.ppt

定点突变提高植酸酶的表达量 植酸酶的生产菌株表达量低，难以获得大量产品，使生产成本太高，利用高效表达系统作为生物反应器，大规模低成本地大量生产植酸酶，无疑是解决这一问题行之有效的方法之一。 利用毕赤酵母表达植酸酶可以获得大量产品，表达量由原始菌株的每毫升几微克提高到1-10毫克，并能在酵母中进行糖基化修饰等蛋白质翻译后加工，提高酶的生物活性。 为了提高植酸酶在酵母中的表达率，可通过定点突变将部分在毕赤酵母中低偏爱性的密码子替换为高偏爱性的密码子。 姚斌等对在毕赤酵母中表达的植酸酶基因phyA2进行了Arg密码子的优化突变，将4个Arg密码子(有3个编码Arg密码子是CGG，1个是CGA)突变成高频使用的AGA， Arg密码子优化后其表达量可达每毫升培养液15000u，比Arg秘密子没有优化的表达量提高了近37倍。 改善植酸酶的热稳定性 植酸酶熔点在56-63℃之间，加工饲料都需经过一个制粒工艺，在制粒过程中有一个短暂的高温过程，温度一般在75-93℃，而一般植酸酶的活性在此高温下将大幅度的不可逆地丧失； 饲料用酶又必须在常温下具有较高的酶活性，因为饲料用酶最终的作用场所是动物正常体温(37℃左右)的肠胃道中； 获得热稳定性改善的饲用酶，往往引起：(l)邻近氨基酸残基间氢键、盐键和二硫键的形成；(2)增加疏水相互作用及离子间相互作用，或α-螺旋、β-折叠、β-转角的稳定性等。 改良饲用植酸酶的最适PH 要使植酸酶能在畜禽体内产生有效的催化作用，就必须使酶与畜禽的生理条件(体温及消化道的pH值)相适应。 不同的动物消化道的pH值不同，即使是一种动物在消化道的不同部位pH值也不同，一般的pH值胃为1.5-3.5，小肠为5-7、大肠为7左右。因此要求饲用酶对pH值有较大的适应范围。 pH值主要影响酶活性部位上关键残基的侧链基团或底物的解离，使酶与底物不能结合，或结合后不能进一步反应生成产物。 可通过对氨基酸残基的置换，改变活性中心的氢键网，或改变氨基酸残基的电子环境。从而改变催化基团的pKa值（酸度系数）。 通过定点突变改变真菌和同序植酸酶的pH活性范围，用Lys、His替换野生的A.fumigatus (烟曲霉菌 )植酸酶Gly277、Tyr282，将产生第2个最适pH在2.8-3.4。 在同序植酸酶和A.fumigatus中K68A单点突变，以及在植酸酶进行S140Y，D14lG双突变，以植酸为底物将降低最适声值0.5-1.0单位，而酶的比活力没有明显变化。 葡萄糖异构酶（GI），又称D-木糖异构酶，属微生物酶类。1957年最早在嗜水假单胞菌中发现其活性，后来又发现近百种细菌和放线菌能合成该酶，其中绝大多数为胞内酶，只有极少数菌株能分泌胞外酶。葡萄糖异构酶能将D-葡萄糖、D-木糖和D-核糖等催化为相应的酮糖。在体外一定条件下，它也能催化D-葡萄糖转化为果糖，因而成为工业上制备高果糖浆（HFCS）的关键酶；它还可用于含木聚糖类物质发酵生产乙醇，是一种具有重大经济价值的工业用酶。 葡萄糖异构酶（EC5.3.1.5） （一）葡萄糖异构酶的基本性质 葡萄糖异构酶能催化D-葡萄糖异构化生成D-果糖，也可将木聚糖异构化为木酮糖，此外还能以D-核糖、L-阿拉伯糖、L-鼠李糖及葡萄糖3、5、6碳的修饰衍生物为催化底物，但是它只能催化D-葡萄糖或D-木糖的α-旋光异构体，而不能催化β-旋光异构体。 葡萄糖异构酶的最适温度一般在70-80℃，最适pH7.0-9.0，微偏碱性，不同种属来源的酶有一定的差别。葡萄糖异构酶的最适温度、最适pH值及稳定性还受到缓冲液种类、底物浓度、激活剂、稳定剂及反应时间的影响。另外二价金属离子对酶活力、稳定性及酶的专一性都有影响。 （二）葡萄糖异构酶的蛋白质工程 直接发酵生产的GI应用在工业生产中，已经取得了令人瞩目的成功，但仍存在一定局限性，如最适pH值为碱性、高温下稳定性还有待提高等。偏碱性条件下糖不稳定易焦化，使总产率下降；高温条件有利于反应进程的加快和平衡点的向果糖方向移动，因此对GI进行定向改造成为客观迫切的需求，而蛋白质工程技术，可在研究GI结构－功能关系的基础上，通过对某些氨基酸的替代和修饰，改变GI的结构性质，改善其工业应用性能。 表6-1 SM1033葡萄糖异构酶定点突变及其性质 突 变 性 质 K253R 热稳定性小于野生型，比活是野生型1.5倍 N184V 比活和热稳定性远低于野生型 N184D 最适pH值下降了1个单位，pI下降了0.6个单位，酶活为野生型的38.27% A198C 最适温度升高8℃，酶活为野生型的86.95% Q20L 最适反