蛋白质含量研讨.ppt

* 第一部分 蛋白质含量测定方法简介 一、双缩脲法测定蛋白质的含量 （一）目的与要求 1.掌握双缩脲测定蛋白质含量的原理与方法； 2.了解比值法在物质定量测定中的应用。 （二）实验原理 双缩脲(NH2—CO—NH—CO—NH2)在碱性溶液中能与Cu2+产生紫红色的络合物（吸收波长540nm)，这一反应称为“双缩脲反应”。蛋白质分子中的肽键也能与铜离子发生双缩脲反应。溶液颜色的深浅与蛋白质含量成正比，而与蛋白质的氨基酸组成及相对分子质量无关。故双缩脲反应可用于蛋白质含量的测定。 类脂、色素等干扰比色，本实验用加入四氯化碳的办法消除这一干扰。 （三）方法 1.比值法 A=kc 本次方法 A标= kc标 （1） A样 =kc样 （2） （1）式 ／ （2）式 得： A标／ A样 = c标 ／ c样 ？ c样 = A样×c标 ／ A标 2.标准曲线法 吸光度(A) 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0 蛋白质含量（mg/管） 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 双缩脲试剂(ml) 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 蒸馏水(ml) 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0 标准蛋白溶液(1mg/ ml) 6 5 4 3 2 1 试管号 试剂 C（有色溶液中被测成分浓度） A 溶液吸光度 （四）思考题 1. CCl4在本实验中的作用是什么？ 2.此法与标准曲线法比较有何优缺点？ 适用 特 点 特征吸收 (nm) 原理 基本属性 方法 大致估计 简单快速 灵敏度高 核酸干扰 280 共轭双键的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸 紫外吸收法 0-1000μg/mL 简单迅速，物质少，灵敏度高；去污剂干扰 595 染料结合法-青色复合物 考马斯亮蓝G250法 一般浓度 5-100μg／mL 同上 灵敏度高 100倍 650 肽键与铜离子发生双缩脲反应:钨蓝和钼蓝 Folin-酚法 一般浓度 30-500μg／mL 简单、迅速 灵敏度一般 类脂、色素等干扰 540 肽键与铜离子发生双缩脲反应 双缩脲法 二、几种蛋白质定量测定方法比较 三、思考题 1．紫外吸收法与Folin-酚比色法测定蛋白质含量相比，有何缺点及优点？ 2．若样品中含有核酸类杂质，应如何校正？ 3.试说明考马斯亮蓝G250法的优缺点。 一、概念、用途、设备和基本操作 1.概念：离心技术是利用离心机旋转时产生的强大离心力对大小、形状和密度不同的混合物进行分离的一种方法。 2.用途： 分离细胞器、大分子物质； 固、液相分离； 测定某些纯物质的个别性质。 3.设备：离心机 4.基本操作： 第二部分 离心技术简介 （1）将待分离的物质悬浮于一定的介质中，装入离心管； （2）精确平衡之后，对称放置于转头的插孔中； （3）当转头旋转时，各种物质粒子在离心力作用下因各自大小、形状和密度的差异而以不同速度沉降，一段时间后，即被分离。 二、离心（centrifugation）分离的基本原理 t:沉降时间 h:悬浮介质的黏度 rp:颗粒半径 rp:颗粒密度 r：介质密度rt:旋转中心到液面的距离 rb:旋转中心到管底的距离 ? - 角速度? 1. 粒子的沉降速度 由公式可知，在一定离心场中，颗粒的沉降速度不仅与离心力有关，而且与颗粒大小、密度以及介质黏度有关。一组不同的颗粒在同一条件下离心时则可以根据它们的密度和颗粒大小而分离。 2. 相对离心力 (relative centrifugal foce RCF) 离心场产生的离心力的表示： 习惯使用法：转速—— 转/分（r/min） 缺点：如果旋转半径不同，则粒子所受的离心力不同 标准法：相对离心力（RCF ） 表示方法：数字×g g为重力加速度，即相对离心 力为重力加速度的倍数 如：10000×g 相对离心力与转速的换算 计算法 RCF = 1.119×10-5×（r/min)2×r×g 图表法 根据旋转半径（r）、RCF、r/min 的列线计算图进行换算 RCF与r/min列线计算图 已知r和r/min求RCF 已知r和RCF求r/min 三、离心机 (centrifuge) 1. 制备离心机 2. 分析离心机 属于超速离心机，具有光学观测系统。 制备离心机适用范围 用途 特点 最大相对离心力（×g） 最大转速 （r/min） 细胞器分级分离、病毒、DNA、RNA、蛋白质分