N乙酰半胱氨酸对BDE209致新生鼠海马神经元氧化损伤的影响和初步探讨BDE209对海马神经元DNA甲基化水平的影响.pdf

广州医学院硕士论文 NAC 对BDE-209 致神经元氧化损伤的影响及探讨BDE-209 对甲基化水平影响 记忆能力方面；而且近年发现乳汁中PBDEs 的含量不断增加，母乳喂养的婴儿体内 含有PBDEs 的水平比非母乳喂养的婴儿高，而且婴幼儿体内PBDEs 的浓度比成年人 要高，这除了与母乳喂养有关之外，与接触房屋中的垃圾及婴幼儿排泄 PBDEs 的能 力较低有关系。可见，对BDE-209的深入研究，对人类的环境健康及优生优育都具有 重要的意义。 我们的研究小组在前期实验中，对原代胎鼠海马神经元细胞进行 BDE-209 染毒 后，发现在一定剂量的BDE-209作用下，原代胎鼠海马神经元细胞可发生凋亡及氧化 损伤，并存在一定得剂量-反应关系，推测氧化应激可能是BDE-209 引起神经毒性的 重要机制之一。但目前 BDE-209 是如何导致学习记忆能力下降的机制仍不清楚，有 否基因毒性仍不明确。 本课题主要在细胞水平上研究抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）对BDE-209 致原 代培养海马神经细胞氧化损伤的影响以及初步研究 BDE-209 对原代培养海马神经元 细胞整体 DNA 水平甲基化的影响。DNA甲基化是一种基因表达调控的重要机制，在 很多毒物毒性及疾病中起重要作用；正常DNA甲基化对于中枢神经功能具有重要意义， 异常DNA甲基化状态与肿瘤、智力发育迟缓、免疫缺陷等疾病有一定的相关；对DNA 甲基化状态的正确评估，有助于我们对BDE-209毒理机制的深入了解。本课题主要分 为以下三部分： 第 一 部 分 N-乙酰半胱氨酸对BDE-209致新生鼠海马神经元形态学改变的影响 【实验目的】 取新生24小时内的SD大鼠海马组织进行原代神经元细胞培养，鉴别神经元的纯度， 观察N-乙酰半胱氨酸对BDE-209引起原代培养新生鼠海马神经元细胞形态结构的改变 及细胞存活率下降的影响。 【材料与方法】 1.购买新生24小时内的SD大鼠，取海马组织进行原代神经元细胞培养。 2.培养7天后海马神经元细胞进行神经元细胞纯度鉴别。 2 广州医学院硕士论文 NAC 对BDE-209 致神经元氧化损伤的影响及探讨BDE-209 对甲基化水平影响 3.原代培养7天的新生鼠海马神经元细胞分成11组，即对照组和实验组，对照组分为 空白对照组（含有含1‰DMSO的培养液）和NAC对照组（含有0.1mmol/L NAC的培养 液）。实验组分成I组（BDE-209单独染毒组）、II组（BDE-209与NAC同时作用）及 III组（NAC先作用24小时后，BDE-209再染毒），各大组中均含有3个浓度的BDE-209 小组， BDE-209浓度分别为10、30、50ug/ml。NAC浓度均为0.1mmol/L。每组设3个 平行样，实验重覆3次。染毒24h后，在倒置显微镜下进行细胞形态观察。 4.MTT比色分析检测神经元的存活率。 【结果】 1.原代海马神经元细胞培养第7天观察神经元细胞生长良好,胞体较大,胞突主干 和分枝明显延长并增粗，其突起形成稠密的神经网络。 2.免疫细胞化学法NeuN鉴定神经元的经典方法。由结果可见分散的海马神经元,神 经元是主体,可占95%。 3.倒置显微镜观察不同实验组神经元细胞形态，在实验I组中的10ug/ml组、30ug/ml 组、50ug/ml组中可见神经元细胞胞体有所变小，变形，细胞膜完整但出现发泡现 象，随着染毒剂量加大，发泡现象明显，其神经突起出现缩短，在50ug/ml组中可 见有细胞出现皱缩、变圆、脱落，突起缩短甚至消失。在实验II组与III组中均可见 神经元细胞胞体变形现象、细胞膜发泡现象有所减少，实验II组与III组之间的细胞 形态无明显差异。 4.MTT比色分析检测神经元的存活率，随BDE-209浓度增加，神经元细胞的存活率明 显下降 (P0．05)，II组及III组中的神经元细胞存活率均有所升高，但III组的 神经元细胞存活率与I组比较，无统计学意义（P0.05）。在II组与I组的细胞存 活率比较，有明显增高（P0.05），有统计学意义（P0.05）。 【结论】 BDE-209可引起原代培养新生鼠海马神经元细胞形态改变、细胞存活率下降，这与 BDE-209有一定量效关系，NAC能改善BDE-209对海马神经元细胞