第二章_电镜酶细胞化学技术与电镜免疫细胞化学技术资料.pptVIP

第二章 电镜酶细胞化学技术与电镜免疫细胞化学技术 概述 电镜细胞化学技术 电镜细胞化学技术是电镜技术与细胞化学技术相结合产生的一门新技术，也称超微结构细胞化学。 目的：将化学研究与形态观察相统一，要求在细胞超微结构水平上研究细胞内各种生化物质（蛋白质、核酸、脂肪、碳水化合物等）的定位情况以及这些生化物质在细胞内的动态变化，用以阐明细胞、细胞器结构与功能的相互关系。 电镜细胞化学技术主要包括： 电镜酶细胞化学技术 电镜免疫细胞化学技术 特异酶消化印证技术 电镜放射自显影技术 电镜原位杂交技术 超微示踪技术等 第一节 电镜酶细胞化学技术 ★ 目的： 在超微形态保存良好的组织上，在酶存在的部位显示酶活性。侧重于显示细胞器的标志酶及其动态变化。 目前能在电镜下定位的酶有三大类即水解酶、氧化酶和转移酶 ★ 电镜酶细胞化学与光镜酶组织化学的比较： 光镜酶组织化学 电镜酶细胞化学 分辨率低 分辨率高 难于鉴别细胞器和酶的精确位置 易于鉴别和定位 反应产物为有色沉淀 反应产物必需有高电子密度 可显示100多种酶 可显示40余种酶 ★电镜酶细胞化学的基本原理 酶细胞化学反应 酶+底物 初级反应产物 最终反应产物 ?  （可溶性） （不溶性） 常用捕捉剂有：重金属（铅、钡、铜）盐、重氮盐、二氨基联苯胺等。 ★ 电镜酶细胞化学反应的主要方法 ② 酶作用于底物，底物之一为生理底物，在反应中被氧化，底物之二为捕捉底物，在反应中被还原，被还原的捕捉底物与加入的重金属捕捉剂形成金属盐沉淀。 琥珀酸脱氢酶 琥珀酸盐 铁氰化物 延胡索酸盐 亚铁氰化物 Cu2+ 亚铁氰化铜（高电子密度） （2）非金属有机化合物沉淀法 常用底物为α-醋酸萘酚、萘酚AS-β-葡萄糖苷酸、 β-萘酚磷酸钙等萘酚系列衍生物。 用于显示糖苷酶、磷酸酶、酯酶等。 初级产物：萘酚 萘酚+捕捉剂重氮盐 偶氮色素 （3）锇化法 嗜锇物质生成法 在酶作用下，生成“嗜锇”性捕捉底物，经锇酸作用后形成高电子密度的锇黑 ★电镜酶细胞化学的常规操作流程 酶细胞化学技术包括三个基本过程：①酶的固定，使酶固定在组织细胞所在部位，防止移位；②酶的特异性反应；③使反应产物在显微镜下可见。第一过程在样品制备中完成，后两个过程包含在孵育反应中。 取材（3×8mm）→ 固定（酶固定+结构固定）→ 切组织片（40-60um）→ 孵育（酶反应+捕捉反应）→ 脱水、包埋 → 超薄切片 → 电镜观察 1、固定：常规固定液选取2.5%戊二醛和4%多聚甲醛混合液作为固定液，根据不同酶的特性，也可以单独使用其中一种作为固定液。 选择固定剂 原则上优先考虑保存酶活性，一般采用醛类固定剂。甲醛对酶活性的保存优于戊二醛，但对细胞超微结构的保存略差。戊二醛对细胞的超微结构的保存优于甲醛，为发挥二者的长处，可采用甲醛戊二醛混合固定液。 固定的温度与时间 固定液的使用温度一般是0-4℃。固定时间视目标酶对固定剂的敏感程度而定缓冲液 一般固定液需要用缓冲液配置，具体使用何种缓冲液要看具体酶的性质而定。常用的缓冲液有醋酸缓冲液、磷酸缓冲液、Tris缓冲液以及二甲砷酸钠缓冲液等。 2、切片：一般采用组织切片机进行切片，厚度在40～60μm，也可以用冰冻切片机切片。 3、漂洗：用配置孵育液的缓冲液进行漂洗3次，每次10分钟。 4、孵育：孵育时必须在使用前配置新鲜孵育液。将切片放入孵育液内，在震荡式恒温水浴箱中孵育，孵育温度一般为37℃。孵育时间因器官和酶的种类不同而有很大差异(具体时