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微生物大实验——土壤中芽孢杆菌的分离及鉴定实验报告 学 院：生命科学学院 专 业：生物技术 班 级： 组 数: 学 号: 姓 名:  前言 芽孢杆菌是能形成芽孢 (内生孢子)的杆菌。芽孢是休眠体，不是繁殖体。绝大多数是一个菌体仅形成一个芽孢芽孢位于菌体内,由核心、皮层、芽孢壳和外壁组成。核心是芽孢的原生质体，内含DNA、RNA、可能与 DNA相联系的特异芽孢蛋白质以及合成蛋白质和产生能量的系统。芽孢杆菌属是大的(4–10um), 革兰氏阳性，严格需氧或兼性厌氧的有荚膜的杆菌。该属细菌的重要特性是能够产生对不利条件具有特殊抵抗力的芽孢。芽孢杆菌属可分为以下亚群：多粘芽孢杆菌、枯草杆菌（包括蜡样杆菌和 HYPERLINK /view/1660828.htm \t _blank 地衣芽孢杆菌）、短芽孢杆菌和炭疽芽孢杆菌。芽孢杆菌是一种耐高温、高压及低PH值的有益微生物，本实验从土壤中分离出15株芽孢杆菌，从中挑选出一株芽孢杆菌进行生理生化鉴定，以及分子鉴定。通过进一步的实验，了解到其生理生化特点。 一、实验目的： 掌握芽孢杆菌属常见种的分离、鉴定方法和技术。将土壤样品中分离的芽孢杆菌属未知种鉴定到属。 二、实验原理： 芽孢杆菌能产生芽孢，在沸水中加热不会失去生理活性，但是不能产生芽孢的细菌会失去活性。，因而得到芽孢菌属，经过进一步分离及生理生化鉴定得到枯草芽孢杆菌。 三、实验仪器材料： 1、仪器：显微镜、培养皿、试管、三角瓶、烧杯、移液管、涂布棒、载玻片、接种环、接种针、试管架、灭菌锅、培养箱、电泳仪、PCR仪、提取DNA试剂盒 2、材料：培养基：LB培养基、淀粉培养基、孔雀绿溶液、番红复染液、NaOH溶液、草酸铵溶液、碘液、乙醇、硝酸盐、葡萄糖、甘露醇、阿拉伯糖、木糖 四、实验步骤： （一）、菌种的分离和纯化 1、取样 2、LB培养基的配制： 1L水、10g蛋白胨、5g牛肉膏、10g Nacl、15g琼脂、120℃灭菌30分钟待用 3、平板及斜面的制备 4、制备土壤菌悬液：称取土样约1g土壤放入盛有9ml无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，置于摇床上150r/min,振荡10min。使土样与水充分混合，使细胞分散。用一支1ml无菌吸光吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，此为10-1 稀释液，以此类推制成10-2 ，10-3 ………..10-6等几种稀释度的土壤溶液。 5、涂布：用无菌吸管分别吸取每个梯度0.2ml的土壤溶液，准确放入PDA平板中，用无菌玻璃涂棒在培养及表面轻轻地涂布，使溶液分布均匀。室温下静置5-10min。 6、培养：将平板置于28℃温箱培养1-2天。选择单个菌落挑取少量的菌苔，接种于斜面上。 7、纯化： 挑取单菌落溶于无菌水中，充分震荡摇匀，接种于已灭菌的LB培养基的平板上。 8、初染：将纯化后得到的菌株进行革兰氏染色，并从中挑选出呈紫色的菌株，纯化保种并进行形态学、生理生化及分子鉴定 （二）形态观察： 1、个体形态特征观察 2、群体形态特征观察 （三）芽孢杆菌鉴定的生理生化试验 1、好氧性试验 细菌对氧气的需求是细菌鉴定的重要指标之一。若在培养基中加入还原剂，如巯基醋酸钠和甲醛次硫酸钠，可除去培养基中的氧气或氧化型的物质，使厌氧菌能在有氧条件下生长。 （1）培养基a、胰胨 20g K2HPO4 1.5g NaCl 2.5g 巯基醋酸钠 0.6g 美蓝 0.002g Na2SO3 0.2g L-胱氨酸 0.4g 蒸馏水 1000mL 琼脂 0.5g pH7.2，分装试管（装量约1/2试管），0.1MPa、121℃灭菌15min。b、酪素水解物 20g NaCl 5g 巯基醋酸钠 2g 甲醛次硫酸钠 1g 琼脂 15g 蒸馏水 1000mL pH7.2，分装试管（装量约1/2试管），0.1MPa、121℃灭菌20min，培养基不搁斜面。 （2）试验方法 取一环（接种环外径1.5mm）肉汤培养液，穿刺接种到上述培养基底部，30℃培养3d至7d观察结果。好氧菌在培养基上部生长，厌氧菌则在培养基底部生长。 2、糖发酵试验（木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露醇） 糖类发酵产酸是细菌分类鉴定的一项重要依据。 （1）培养基 (NH4)2HPO4 1g MgSO4·7H20 0.2g