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谷氨酸摇瓶发酵 生物工程xxx xxx xxxxxxxxx 摘要 根据谷氨酸的发酵机理，本实验通过摇瓶补料发酵生产谷氨酸，并对发酵过程中产谷氨酸量、发酵液OD值、残糖量进行连续的测定。试验结果表明：四瓶发酵培养基中，只有添加有玉米浆的发酵培养基产谷氨酸，另外3瓶以酵母膏代替玉米浆成分的发酵液都不产谷氨酸。 关键词：谷氨酸 发酵 摇瓶培养 前言 1.1 谷氨酸发酵机制 在谷氨酸发酵中，生成谷氨酸的主要酶反应有三种：（1）谷氨酸脱氢酶（GHD）所催化的还原氨基化反应；（2）转氨酶（AT）催化的转氨反应；（3）谷氨酸合成酶（GS）催化的反应。 谷氨酸的合成主要途径是α—酮戊二酸的还原性氨基化，是通过谷氨酸脱氢酶完成的。α—酮戊二酸是谷氨酸合成的直接前体，它来源于三羧酸循环，是三羧酸循环的一个中间代谢产物。由葡萄糖生物合成谷氨酸的代谢途径如下图1所示，至少有16步酶促反应。 图1 由葡萄糖生物合成谷氨酸的代谢途径 当生物素缺乏时，菌种生长十分缓慢；当生物素过量时，则转为乳酸发酵。因此，一般将生物素控制在亚适量条件下，才能得到高产量的谷氨酸。目前工业上应用的谷氨酸产生菌有谷氨酸棒状杆菌、乳糖发酵短杆菌、散枝短杆菌、黄色短杆菌、噬氨短杆菌等。我国常用的菌种有北京棒状杆菌、纯齿棒状杆菌等。 随后转入谷氨酸合成阶段，此时菌体浓度基本不变，糖与尿素分解后产生的α- 酮戊二酸和氨主要用来合成谷氨酸。这一阶段应及时流加尿素以提供氨及维持谷氨酸合成最适pH 7.2～7.4，需大量通气，并将温度提高到谷氨酸合成最适温度34～37℃。 发酵后期，菌体衰老，糖耗慢，残糖低，这时应减少流加尿素量。当营养物质耗尽，谷氨酸浓度不再增加时，及时放罐，发酵周期约为30 h。 材料和方法 菌种选择：天津短杆菌。 实验器皿的准备： 带10ml刻度的比色管24支，离心管12个，枪头灭菌并烘干（80℃烘4小时）约200支，灭菌移液管1ml5支。 配置培养基及相关试剂： 2.3.1活化斜面培养基（g/L）（5支，10ml/支） 葡萄糖10，蛋白胨10，牛肉膏10，酵母膏5，NaCl12.5，琼脂15～20，Ph7.0～7.2，分装大试管约10ml/支，灭菌：115℃，25min，斜面高度占试管高度的2/3。 2.3.2种子培养基（g/L）（2瓶，30ml/瓶） 葡萄糖26，玉米浆40，K2HPO41.4，MgSO40.8，20%尿素过滤除菌，1.2ml/30ml培养基（终浓度0.8%，接种前在无菌室加入），分装30ml/500ml三角瓶，灭菌：115℃,25min。在无菌室加入尿素后调节pH7.0～7.2。 2.3.3摇瓶发酵培养基（g/L）（6瓶，30ml/瓶） 葡萄糖70/80/90，玉米浆（或酵母膏）3，MgSO40.8，K2HPO43.5，K,H2PO41，20%尿素过滤除菌，1.2ml/30ml培养基（终浓度0.8%，接种前在无菌室加入），分装26ml/500ml三角瓶，灭菌：115℃,25min。在无菌室加入尿素后调节pH7.2～7.5。 2.3.4相关试剂的配制 1）0.9%生理盐水：称取0.9gNaCl溶于蒸馏水并定溶至100ml。 2)50%葡萄糖配法：称取50g葡萄糖溶于蒸馏水并定溶至100ml，用于补料。 3）20%尿素：称取22g尿素溶于蒸馏水并定溶至100ml，过滤除菌。 4）3mol/LHCl：取12mol/L浓HCl，令HCl:H2O为1:3（体积比）配制100ml。 5）2mol/LNaOH：称取8gNaOH固体溶于蒸馏水并定溶至100ml。 实验步骤 2.4.1转接活化斜面： 将菌种TG866转接划满活化斜面，32℃培养20h。 2.4.2种子培养： 向已灭菌的种子培养基加入尿素（1.2ml/瓶），用2mol/LNaOH或2mol/LHCl调至Ph7.0～7.2。按1ml生理盐水/1支大试管斜面的用量，将活化斜面上菌种洗下，混匀。按3%的接种量（1ml）Ph7.2～7.5，将种子培养基按10%的接种量（3ml）） 葡萄糖100 加酵母膏① 葡萄糖100 加酵母膏② 葡萄糖70 加酵母膏① 葡萄糖70 加玉米浆② 0 0.831 0.802 1.205 0.894 3 0.926 0.89 1.277 0.858 6 1.01 0.96 1.366 0.849 9 1.054 0.971 1.415 0.95 12