实验三传代细胞培养和病毒感染力(TCID50)的滴定教程.ppt

在1.5ml离心管中将伪狂犬病毒(PRV)作连续10倍的稀释，从10-1-10-10。 将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中，每一稀释度接种一纵排共8孔，每孔接种100μl。 在每孔加入细胞悬液100μl，使细胞量达到2~3×105/ml 设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排(100μl生长液+100μl细胞悬液） 逐日观察并记录结果，一般需要观察5-7天。 结果的计算，Reed-Muench两氏法或 Karber法 lgTCID50=L-d(s-0.5) L：最高浓度的稀释度的对数 d：稀释度对数之间的差 s：阳性孔比率总和 lgTCID50=-1-1×(3.375-0.5)=-3.875 TCID50=10-3.875/0.1ml * 实验三 传代细胞培养和病毒感染力（TCID50）的滴定 了解不同传代细胞的形态、传代方法。 了解病毒感染力测定的几种方法。 掌握半数细胞培养物感染量TCID50的操作步骤、计算方法及含义。 一、实验目的 二、材 料 96孔细胞培养板、加样器(200ul)、枪头、Eppendorf管(1.5ml) BHK-21细胞 培养液：含5%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM 伪狂犬病病毒液（PRV） 三、传代细胞系培养方法 取长满单层的细胞一瓶，倾去培养液。 加入1-2ml 胰酶消化液，于37℃培养箱放置几分钟，至细胞间出现空隙或细胞变圆后，倒去消化液。 加入生长液，反复吹打几次，使细胞分散成单个细胞，然后分装于2-3个小瓶中。再在每个小瓶中补充生长液至10ml，然后置37℃培养箱培养，培养1-2天即可长成单层。 四、病毒在细胞中的培养 选长满单层的细胞，倒掉培养液。 加入适量的病毒悬液 置温箱中感作（吸附）45min-1h。 取出瓶子，倒掉或不倒掉病毒液，补足维持液，置温箱中继续培养，直至细胞病变。 收毒：将病变的细胞置于-20℃冰箱中，冻结后取出自然解冻，在解冻过程中要振摇几次，以使细胞完全从瓶壁上脱落。然后将病毒液收集于盐水瓶或其它容器中。低温贮藏备用。 １、半数致死量(50% lethal dose, LD50 ): 指能使接种的实验动物于感染后一定时间内死亡一半所需的活微生物量或毒素量。 ２、半数鸡胚感染量(egg 50% infective dose, EID50): 指能使半数试验对象(动物、鸡胚或细胞)发生感染的病原微生物的量。 ３、组织培养半数感染量(50% tissue culture infective dose, TCID50) 4、蚀斑形成单位(plaque forming unit ,PFU) 五、测定病毒感染力的方法 六、TCID50的操作步骤 七、TCID50的计算方法 CPE：Cytopathic effect 1、Reed-Muench法 距离比例＝（91.6-50）/（91.6-40）＝0.8 lgTCID50=距离比例×稀释度对数之间的差+高于 50%病变率的稀释度的对数 =0.8×(-1)+(-3) =-3.8 TCID50=10-3.8／0.1ml 含义:将该病毒稀释103.8倍接种96孔细胞培养板，每孔100μl，可使50%接种孔的细胞发生病变 2、Karber法 * *