琼脂糖凝胶电泳检测质粒总结.pptVIP

琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA 一、实验原理 实验仪器：电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，微波炉，紫外透射检测仪等 实验试剂：琼脂糖，TAE电泳缓冲液，溴化乙锭（EB），上样缓冲液 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。 溴化乙锭（EB） 溴化乙锭（EB）是一种吖啶类染料，它在紫外灯照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的EB就插入DNA分子中形成荧光络合物，使DNA发射的荧光增强几十倍，电泳后就可直接紫外灯照射下检测琼脂糖中的DNA。 上样缓冲液 迁移方向 DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷 DNA迁移方向？ 点样孔朝向？ DNA分子大小 线形的双链DNA分子在凝胶中迁移的速率与其碱基数的对数成反比。 分子越大，迁移越慢。一是摩擦阻力越大，二是大分子通过凝胶孔径的效率低于较小的分子。 DNA分子的构象 不同构象DNA分子在电场中移动的距离不同。具有相同分子量的线状、开环状和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度不同。 迁移速度？ 二、实验方法 制备1%的琼脂糖胶液：取0.4g琼脂糖溶于40mL TAE中。 在短时间里加热琼脂糖全部熔化。使溶液冷却至60℃。(加入EB ，使EB的终浓度为1μg/mL)。 将温热琼脂糖倒入胶床中，凝胶的厚度在3—5mm之间，凝固约30min。 在凝胶完全凝固之后，小心移去梳子，将胶床放在电泳槽内，加样孔一侧靠近阴极（黑极）。 向电泳槽中注入适量的TAE缓冲液，通常缓冲液高于胶面1cm。 将适量的质粒样品与加样缓冲液混合,用移液枪将样品加入加样孔。 电泳结束后，在紫外观测仪上进行观察 Thanks * * 琼脂糖凝胶电泳：是常用的用于分离、鉴定及纯化DNA分子标准方法，这种电泳方法以琼脂糖凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。 电泳缓冲液 Tris—乙酸（TAE） Tris—硼酸（TBE） Tris—磷酸（TPE） PH为7.5—8.0,这些缓冲液均含有EDTA。 Ⅰ 0.25%溴酚蓝 ，0.25%二甲苯青 ，40%蔗糖水溶液 Ⅱ 0.25%溴酚蓝 ，0.25%二甲苯青 ，30%甘油水溶液 各成分的作用？ 常用的10X上样缓冲液 加样缓冲液可以增大样品密度，以确保DNA均匀进入样品孔内，还可以使样品呈现颜色，从而使加样操作更为便利。 溴酚蓝在琼脂糖凝胶中移动的速率约为二甲苯青FF的2.2倍, 溴酚蓝在琼脂糖凝胶中移动的速率约与长300bp的双链线性DNA相同,而二甲苯青FF在琼脂糖凝胶中移动的速率则与4kb双链线性DNA相同。 DNA分子大小 DNA分子的构象 影响DNA迁移率的因素 正确连接电泳槽和电源，设定稳压为3-5V/cm。 结果分析 * * * 不同DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。