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细胞电生理研究进展 一 电压钳（voltage clamp）技术 （一）电压钳 基本原理 离子通道电流: 细胞膜上的电流 膜电容充放电电流 电压钳技术－－消除膜电容电流的影响 电压钳技术的基本原理：用微电极将膜电压钳制到新的数值上，保持一段时间不变使膜电容完成充放电过程进入电压钳制的稳态期， 测得的跨膜电流可以认为来自于离子通道电流。 （二）理想的电压钳 （三）双电极电压钳 加记录电极实现闭环电路的反馈控制 （四）单电极电压钳 在电压钳制的稳态期，钳制电压VC = Vm ×(Rm ＋RCE)/Rm 只有当钳制电极的电阻RCE远小于细胞膜电阻Rm时，Vm≈VC 二、膜片钳实验技术 膜片钳技术是细胞生物学研究的一个重大发明。 （一）膜片钳技术发展历史 ?????? ?1976年德国马普生物物理化学研究所Neher和Sakmann首次在青蛙肌细胞上用双电极钳制膜电位的同时，记录到ACh激活的单通道离子电流，从而产生了膜片钳技术。???1980年Sigworth等在记录电极内施加5-50 cmH2O的负压吸引，得到10-100GΩ的高阻封接（Giga-seal），大大降低了记录时的噪声实现了单根电极既钳制膜片电位又记录单通道电流的突破。?????1981年Hamill和Neher等对该技术进行了改进，引进了膜片游离技术和全细胞记录技术，从而使该技术更趋完善，具有1pA的电流灵敏度、1μm的空间分辨率和10μs的时间分辨率。? 1983年10月，《Single-Channel Recording》一书问世，奠定了膜片钳技术的里程碑。Sakmann 和Neher也因其杰出的工作和突出贡献，荣获1991年诺贝尔医学和生理学奖。 （二）膜片钳技术的原理 同电压钳，用特制的玻璃微吸管吸附于细胞表面,使之形成10～100的密封(giga-seal)，被孤立的小膜片面积为μm量级,内中仅有少数离子通道。使与电极尖开口处相接的细胞膜的小区域（膜片）与其周围在电学上绝缘，然后对该膜片实行电压钳位，可测量单个离子通道开放产生的pA（10安培）量级的电流，这种通道开放是一种随机过程。通过观测单个通道开放和关闭的电流变化，可直接得到各种离子通道开放的电流幅值分布、开放几率、开放寿命分布等功能参量，并分析它们与膜电位、离子浓度等之间的关系。还可把吸管吸附的膜片从细胞膜上分离出来，以膜的外侧向外或膜的内侧向外等方式进行实验研究。这种技术对小细胞的电压钳位、改变膜内外溶液成分以及施加药物都很方便。 （一）膜片钳技术的原理 (二 )膜片钳电极的制备 1. 标本制备　根据研究目的的不同，可采用不同的细胞组织，如心肌细胞、平滑肌细胞、肿瘤细胞等，现在几乎可对各种细胞进行膜片钳的研究。对所采用的细胞，必须满足实验要求，一般多采用酶解分离法，也可采用细胞培养法；另外，由于与分子生物学技术的结合，现在也运用分子克隆技术表达不同的离子通道，如利用非洲爪蟾卵母细胞表达外源性基因等。 2. 电极制备　合格的膜片微电极是成功封接细胞膜的基本条件。要成功的封接细胞膜需要两方面的因素保证，一是设法造成干净的细胞膜表面，二是制成合格的电极。首先要选择适当的玻璃毛细管，其材料可使用软质玻璃（苏打玻璃、电石玻璃）或硬质玻璃（硼硅玻璃、铝硅玻璃、石英玻璃）。软玻璃电极常用于作全细胞记录，硬质玻璃因导电率低、噪声小而常用于离子单通道记录。 3 .电极在实验前要灌注电极液，由于电极尖端较细，因此在充灌前，电极内液要用0.2 μm的滤膜进行过滤。一般电极充灌可分灌尖(tipfilling)和后充(backfilling)两步。灌尖时将电极尖端浸入内液中5s即可，由于毛细作用溶液会进入电极最尖端处，然后从电极后端用细小的聚丙烯注射管插至尖端附近将溶液充至1/4长度，用手指轻轻弹除尖端残留的气泡即可。灌注后的电极电阻一般为2～5MΩ，而全细胞记录则最好在2～3MΩ。 4. 进行实验，记录和分析数据　准备工作就绪后即可进行实验操作，数据记录和分析 膜片钳实验技术的新发展 膜片钳实验技术的新发展 目前膜片钳技术已从常规膜片钳技术（Conventional patch clamp technique）发展到全自动膜片钳技术（Automated patch clamp technique）。 传统膜片钳技术每次只能记录一个细胞（或一对细胞），对实验人员来说是一项耗时耗力的工作，它不适合在药物开发初期和中期进行大量化合物的筛选，也不适合需要记录大量细胞的基础实验研究。全自动膜片钳技术的出现在很大程度上解决了这些问题，它不仅通量高，一次能记录几个甚至几十个细胞，而且从找细胞、形成封接、破膜等