实验四葡萄糖淀粉酶的固定化.ppt-湖北民族学院.pptVIP

实验四：葡萄糖淀粉酶（糖化酶）的固定化及固定化酶活力测定 湖北民族学院生物科学与技术学院 1、实验目的 初步掌握包埋法制备固定化酶的步骤以及测定固定化酶活力的方法，为今后开展类似研究打下基础。 2、实验原理 把糖化酶悬浮在海藻酸钠溶液中。滴入氯化钙溶液。形成海藻酸钠凝胶小球。酶包埋在凝胶的小孔中，制成固定化酶。 糖化酶活性测定原理：在一定条件下能水解淀粉生成葡萄糖。葡萄糖的醛基被弱氧化剂次碘酸钠氧化、过量的碘用硫代硫酸钠滴定。从碘的减少量计算葡萄糖的量，从而计算酶活力。 3、试剂和器材 固定化酶试剂： 2%海藻酸钠溶液：200 ml 2%氯化钙溶液；1000 ml 葡萄糖淀粉酶（糖化酶）：25 g 固定化酶活力测定试剂： 2%可溶性淀粉： 0.1 mol/L醋酸缓冲液pH4.6 酶液/灭活酶液 0.1 mol/l 碘液 0.1 mol/l 氢氧化钠 1 mol/l 硫酸溶液 0.5% 可溶性淀粉 0.05 mol/l 硫代硫酸钠溶液 主要仪器： 电子天平；注射器；碘量瓶；pH计；恒温水浴锅，酸碱滴定管等。 4、实验方法和步骤 4.1固定化酶的制备 将海藻酸钠溶液于45℃水浴保温； 取糖化酶1g，悬浮在20 mL海藻酸钠溶液中混合均匀。 用注射器吸取上述悬浮液，逐滴滴入到50mL氯化钙溶液中，浸泡20 min左右。 滤出凝胶珠用蒸馏水洗涤几次，除去凝胶珠表面的酶，得到固定化酶，（并称重）置于4℃冰箱中冷藏备用。 4.2糖化酶活力测定 吸取上述反应液5 mL于碘量瓶中，加入0.1 mol/L碘液及0.1 mol/L氢氧化钠溶液各5 mL，混匀，于室温下在暗处放置15 min，加入2 mL硫酸酸化。 4个试管中各加入0.5%可溶性淀粉为指示剂1mL；用0.05 mol/L硫代硫酸钠溶液滴定至蓝色消失为终点。记录硫代硫酸钠溶液消耗的毫升数A，以及空白实验消耗的硫代硫酸钠溶液毫升数B。 5、数据处理 （1）酶活力计算 在上述条件下，每小时催化淀粉水解生成1 mg葡萄糖定义为一个酶活力单位。 （2）固定化酶活力回收率计算。 * * I2+2NaOH→NaIO+NaI+H2O NaIO+CH2OH(CHOH)4CHO→CH2OH(CHOH)4COOH+NaI I2+2Na2S2O3→Na2S4O6+2NaI I2+2NaOH→NaIO+NaI+H2O NaIO+CH2OH(CHOH)4CHO→CH2OH(CHOH)4COOH+NaI （3）固定化酶比活力计算：