分子生物学人类基因组DNA提取等摘要.pptVIP

一.材料 一份提取总DNA的细胞或组织 1.5ml、 微量离心管、微量移液器与吸头、15ml离心管、锥形瓶（500或1000ml）。 二.设备 离心机、电子天平、恒温水浴箱、紫外分光光度计、电泳仪、电泳槽、凝胶成像仪、微波炉或沸水浴、透射紫外灯。 三.试剂 1.细胞核裂解液(STE)：0.1 mol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA 2.0.8%（W/V）标准琼脂糖； 3.0.5×TBE缓冲液 4.其他试剂：TE缓冲液或重蒸馏水、氯仿/异戊醇（24:1，V/V）、异丙醇或无水乙醇、电泳加样缓冲液、溴化乙锭（EB） 实验材料 1.生理盐水 2.1×细胞核裂解液（SET）：0.5ml 2mol/L Tris-HCl pH8.2 ，10ml 4mol/LNaCl ，0.4ml 2mmol/LEDTA，加蒸馏水至100ml 3.10%SDS：SDS10g，加水至100ml 4.20mg/ml蛋白酶K 5.Tris-饱和酚 6.氯仿 7.无水乙醇 8.TE（缓冲系统）：10mol/L Tris-HCl(PH8.0)，1mol/LEDTA(PH8.0) 1.EDTA：钙离子络合剂，在分子生物学实验中是二 价金属螯合剂，抑制核酸酶，降低细胞膜的稳定性； 2.SDS（十二烷基硫酸钠）：是一种去污剂，破坏细 胞膜的脂质膜； 3.蛋白酶K：一种很强的蛋白水解酶，能消化各种蛋白 质（包括糖蛋白和肽类）及脂类和胺类物质，但糖 蛋白的降解物常与DNA一同沉淀下来，干扰酶的活 性，消化后需要用酚、氯仿抽提纯化； 4.酚：使蛋白质变性，将变性的蛋白质溶解在其中； 5.氯仿：一种有效的蛋白变性剂，能促进两相的分离。 DNA提取原则 1.保证DNA结构的完整性 2.纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质 3.排除有机溶剂和金属离子的污染 4.蛋白质、多糖、脂类等降低到最低程度 5.排除其他核酸分子的污染 四、操作步骤（酚法抽提染色体DNA） （一）DNA的提取 1.采集口腔粘膜脱落细胞，用舌头舔颊粘膜上颚、用牙刮颊部，用分泌出的唾液反复漱口；将唾液吐到杯中。用生理盐水洗涤，12000r/min离心10分钟，倒掉上清；重复1次。 2.沉淀中加1ml 1×细胞核裂解液(STE)，混匀，再加350ml STE和150ml 10% SDS，摇匀，至出现粘稠透明状。加10ml 20mg/ml蛋白酶K，摇匀。37℃温箱过夜或50℃ 3～4小时。 3. 加等体积饱和酚，轻摇混匀10分钟，室温12000r/min离心10分钟，去除蛋白和SDS的沉淀。 4. 小心移上清至另一离心管，加等体积氯仿混匀5分钟，室温12000r/min离心5分钟。 5. 小心移上清，若上清不清亮透明，则用等体积氯仿再抽提一次。 6. 将上清移入另一离心管中，沿离心管壁向DNA溶液中加入2倍体积的无水乙醇，摇匀，静置10min，12000r/min离心10分钟，用新配制的70%乙醇洗两次，室温干燥5分钟，再将DNA溶于20-100ml TE缓冲液中，测OD（吸光度）值。 7. TE溶解的DNA，在4℃下可保存一年，如要求长期保存，则需加2倍体积无水乙醇置于70℃保存。 电泳鉴定 取样品1μl、电泳缓冲液5μl、6×加样缓冲液1μl（含溴酚蓝和二甲苯青FF指示剂及甘油），混匀，在0.8%琼脂糖凝胶上进行水平板微型电泳，用噬菌体λDNA作为标准。 DNA区带应比较集中，泳动速度与λDNA 相同或稍慢，证明分子量均 50kb。一般见不到泳动速度比溴酚蓝快的RNA区带。如果DNA不成区带，而是散开分布在λDNA与溴酚蓝之间，则说明DNA已经被降解成小分子。 限制性核酸内切酶 识别及切割位点 限制性核酸内切酶只能识别特殊的碱基序列，作 用于切断相邻碱基之间的磷酸二酯键； 通常切割4～6个碱基对、具有回文序列的DNA片段， 大多数酶是错位切割双链DNA，产生 5ˊ或3ˊ黏性末端。 如EcoRⅠ切割后产生5ˊ黏性末端： 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳主要是应用琼脂糖凝胶作为支 持物的电泳法，借助琼脂糖凝胶的分子筛作用，核 酸片段因其分子量或者分子形状的不同，电泳速度 有差异而分离，这种技术是基因操作中常用的一种 方法。 与其他支持物电泳最主要区别是：它兼有“分 子筛”和“电泳”的双重作用。 琼脂糖凝胶电泳的应用 （1）适合分离大片段DNA。 琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的 DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶电泳低，但它制备容易，分离范围广，尤其适于分