发酵法生产L-天冬酰胺酶重点.ppt

发酵法生产L－天冬酰胺酶 学生模拟组建运营一个L－天冬酰胺酶生产企业，撰写计划书(在理论教学期间完成)。 市场部：L－天冬酰胺酶的结构、功能、用途，L－天冬酰胺酶市场状况与销售预测，竞争对手状况与分析。 技术部：确定L－天冬酰胺酶生产的工艺流程及工艺参数，编制生产操作规程，确定生产车间的布局。 品控部：制定L－天冬酰胺酶的质量标准，生产取样分析操作规程，质量检测标准和操作规程。 总经理：协调监督各部工作，最后拿出完整的计划书。 L-天冬酰酶生产工艺 一、结构与性质 由四个相同亚基组成，有222个对称轴，每个亚基含326个氨基酸残基。 用于儿童急性淋巴细胞白血病 、单细胞白血病、淋巴肉瘤、胰腺癌等。 机理： 降低人体内天冬酰胺和谷氨酰胺浓度，正常细胞可自我合成，癌细胞不具备这种能力，从而受到抑制。 性状： 白色粉末，微吸湿，溶于水，不溶于有机溶剂。 二、生产工艺 1 工艺路线 2 工艺过程及控制要点 (1)菌种培养 采取大肠杆菌AS1-375，普通牛肉培养基，接种后于37℃培养24h。 (2) 种子培养 16％玉米浆，接种量1％～1.5％，37℃通气搅拌培养4～8h。 (3)发酵罐培养 玉米浆培养基，接种量8％，37℃通气搅拌培养6～8h，离心分离发酵液，得菌体，加2倍量丙酮搅拌，压滤，滤饼过筛，自然风干成菌体干粉。 (4) 提取、沉淀、热处理 每千克菌体干粉加入0.Olmol／L pH8.0的硼酸缓冲液lOL 37℃保温搅拌1.5h，降温到30℃以后，用5mol／L醋酸调节pH4.2～4.4进行压滤，滤液中加入0.2倍体积的丙酮，放置3～4h，过滤，收集沉淀，自然风干，即得干粗酶。 取粗制酶，加入0.3％甘氨酸溶液，调节pH8.8，搅拌1.5h，离心，收集上清液，加热到60℃30min进行热处理。离心弃去沉淀，上清液加2倍体积的丙酮，析出沉淀，离心，收集酶沉淀，用0.01mol／L，pH8.0磷酸缓冲液溶解，再离心弃去不溶物，得上清酶溶液。 (5)精制、冻干 上述酶溶液调节pH8.8，离心弃去沉淀，清液再调pH7.7加入50％聚乙二醇，使浓度达到16％。在2～5℃放置4～5天，离心得沉淀。用蒸馏水溶解，加4倍量的丙酮，沉淀，同法反复1次，沉淀用pH6.4，0.05mol／L磷酸缓冲液溶解，50％聚乙二醇反复处理1次，即得无热原的L—天门冬酰胺酶。溶于0.5mol／L磷酸缓冲液，在无菌条件下用6号垂熔漏斗过滤，分装，冷冻干燥制得注射用L—天门冬酰胺酶成品，每支1万或2万单位。 3 检测方法 取lml0.04mol／L的L—天门冬酰胺，0.5mol／LpH8.4的硼酸缓冲液，0.5ml细胞悬浮液或酶液，于37℃水浴中保温15min后加0.5ml15％三氯醋酸，以终止反应沉淀细胞或酶蛋白，离心取上清液1ml。加2ml奈斯勒试剂和7ml蒸馏水15min后，于500nm波长处比色测定产生的氨。 * * *