Rap1GAP对急性髓系白血病细胞生物学特性的影响和作用机理的研究.pdfVIP

Rap1GAP 对急性髓系白血病细胞生物学特性的影响及作用机理的研究 中文摘要 Rap1GAP 对急性髓系白血病细胞生物学特性的影响及作 用机理的研究 中文摘要 目的和意义 Rap1GAP 属于GTP 酶激活蛋白（GTPase-activating proteins, GAPs ）家族，在Rap1 这种小G 蛋白GTP-GDP 循环中起到重要作用。鸟苷酸交换蛋白（Guanine nucleotide exchange factors, GEPs ）使Rap1 由结合GDP 的非活性状态转化为结合GTP 的活性状 态，而Rap1GTP 的内在水解酶活性很低，需要GAPs 加速GTP 的水解，使活化的下 游信号及时终止。Rap1(Ras-proximate 1)是Ras 家族中的一员，通过MEK/ERK 途径 影响细胞的增殖和分化；并调节integrins 介导的细胞粘附和迁移，许多研究表明Rap1 和肿瘤的关系密切，其上游调节分子也参与了肿瘤的发生发展。近年来在胰腺癌、甲 状腺癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤的研究中发现，Rap1GAP 在这些肿瘤中表达下调， 并且和肿瘤细胞的增殖、迁移相关，Rap1GAP 被认为有可能是一潜在的抑癌基因。 本实验室的前期研究发现 Rap1GAP 可能在骨髓增生异常综合征 （Myelodysplastic syndromes, MDS ）发病机制中起作用。本试验拟通过构建Rap1GAP 慢病毒表达载体 转染急性髓系白血病细胞株和动物体内模型来研究Rap1GAP 对白血病细胞生物学特 性的影响，探讨Rap1GAP 在急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia, AML ）发病 机制中的作用。 方法 第一部分 实时定量PCR 检测AML 患者、非恶性肿瘤血液病患者骨髓单个核细 胞（Bone marrow mononuclear cells, BMNCs ）以及AML 细胞株（NB4 、HL-60、SHI-1 和U937 ）Rap1GAP mRNA 表达水平，Western Blot 检测Rap1GAP 蛋白表达水平； 用含有BamHI 酶切位点的上下游引物将Rap1GAP cDNA 克隆至含有黄绿色荧光蛋白 （Flavovirens fluorescent protein, YFP ）的慢病毒表达载体pRRL-Venus ，磷酸钙共沉 I 中文摘要 R ap1GAP 对急性髓系白血病细胞生物学特性的影响及作用机理的研究 淀法在293T 细胞中进行四质粒系统病毒包装，收集病毒颗粒转染HL-60 和NB4 细 胞，流式分选YFP 阳性细胞，有限稀释法筛选出高表达Rap1GAP 单克隆阳性细胞株 （H1 、H2 和N1 、N2 ）；MTT 法和体外集落培养检测Rap1GAP 对细胞增殖能力影响； ATRA 和TPA 诱导HL-60 细胞分化，ATRA 诱导NB4 细胞分化，24h、48h 和72h 进行NBT 还原试验和流式检测细胞表面抗原CD11b，观察Rap1GAP 对细胞分化能 力影响；As O 诱导HL-60 和NB4 细胞凋亡24h，荧光显微镜观察Rap1GAP 对细胞 2 3 凋亡能力影响；体外跨膜实验和明胶酶谱检测Rap1GAP 对细胞体外侵袭力影响。 第二部分 对 4 周龄的 BALB/c 裸鼠进行切脾、环磷酰胺腹腔注射及全身亚致 死剂量辐照等预处理后随机分空白对照组（n=5 ）和实验组（HL-60 组、空载体MOCK 组、R1 组、R2 组，每组n=8 ）。空白对照组经尾静脉注射0.2ml IMDM，实验组经尾 7 静脉接种1.2×10 含不同细胞的IMDM 液0.2ml，后在层流柜中无菌饲养观察至接种 后60 天。于裸鼠濒死前或死亡后即行解剖，留取骨髓涂片，瑞氏染色观察有无异常 的白血病细胞；各脏器常规病理切片，观察异常白血病细胞在各脏器中