2015秋期生物工程综合实验实训-实验讲述.docVIP

一、实验说明 （一）实验方案 图1 克隆与原核表达简要方案 （二）实验要求与质量控制 综合实验涉及的知识点和实验技术众多，为了培养学生严谨求实、科学求真之精神，并达到综合实验之最大成效，以下对本综合实验过程的要求进行说明，且纳入实验考核成绩。 1、预习 实验前须充分预习，随机抽查时，每一位同学能够清晰的阐述整体实验思路和具体的实验项目、原理。 2、实验过程 除了遵守学校与学院一般实验纪律与要求外，还必须做到主动性、能动性与团队精神相接合，利用有限的资源与时间得到最好的培训与实验结果。为此，本综合实验将能否在规定时间内完成实验内容作为衡量学生动手能力的关键指标之一，并作为考核结果记入实验成绩中。要达到此目的，同学们必须提前仔细阅读实验讲义，全面了解实验内容，透彻理解实验原理，熟悉各个操作步骤，并在实验过程中合理安排时间。 3、实验原始记录与结果整理 每天必须及时、真实、完整地记录当天所做实验情况，记录实验过程中的异常情况，分析其原因，并将下述关键性实验结果整理于实验报告纸： 1）PCR扩增实验结果，凝胶成像图片。 2）菌落鉴定PCR图片。 3）表达进程试验：诱导表达SDS凝胶扫描照片、表达水平。 4、综合实验报告 须按《基因工程（跨课程）综合实验论文撰写规范》撰写、并提交综合实验报告（电子版及电子打印版）。 1）封面： 标题： 基因工程综合性实验论文 组员： 姓名： 学号： 班级： 专业： 指导教师： 南阳师范学院 生命科学与技术学院 3)论文内容 摘要 前言 材料与方法 结果与分析 二、实验内容 猪伪狂犬病病毒变异株HNNYV1 gE基因的克隆 与原核表达 伪狂犬病(Pseudorabies, PR)，是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus, PRV)所引起的一种高度接触传染病。病毒主要在宿主的神经组织细胞内快速增殖并在其细胞与细胞间传播，进而威胁宿主神经系统功能的稳定。因此本病在临床上以神经症状为主要症状。近3年，PR在我国多省份再次爆发，新的变异株在按照正常程序接种过PRV Bartha-k61疫苗的规模化猪场爆发流行，并呈现逐渐严重的趋势，现有研究支持变异株已经成为我国主要流行的病毒株并在抗原性上有所变化。本实验室以从河南某发病猪场分离出一株PRV，命名为HNNYV1。对其gE基因部分片段进行克隆，构建原核表达系统 pGEX-6P-1-gE，经GST-gE融合蛋白，为进一步建立 实验计划： 序号 实验题目 开课专业班级 开课时间 上课地点 计划学时 备注 1 猪伪狂犬病病毒gE基因及空质粒pGEX-6P-1的扩增 2 重组表达质粒pGEX-6P-1-gE的构建 3 重组表达质粒pGEX-6P-1-gE在大肠杆菌中的诱导表达 实验方案： 1. 猪伪狂犬病病毒gE基因及pGEX-6P-1空质粒的扩增1.1实验目的 （1）熟悉病毒基因组的提取方法 （2）掌握PCR、电泳、目的基因片段回收等的操作方法 （3）掌握转化、挑菌等的操作方法1.2 实验材料 （1）材料 猪伪狂犬病病毒胶回收试剂盒、扩增gE基因特异性引物、PCR扩增相关Taq酶、buffer、dNTP和ddH2O等。 （2）仪器 超净工作台、PCR仪 1.3实验设计 根据上课人数在自由组合的基础上组建实验小组，由3～5人的研究小组来完成。 1.4 实验步骤 . 猪伪狂犬病病毒基因组提取 按TRAN（全式金）公司的DNA/RNA提取试剂盒要求操作提取DNA。具体如下： （1）加入20μl Proteinase K于，1.5ml EP管中。 （2）在离心管中加入200μl样品。 （3）加入200μl BB5（含有5.6μg Carrier RNA），涡旋混合15s。 （4）56°C孵育15min。 （5）加入250μl无水乙醇，涡旋混合15s，室温静置5min。（6）将溶液和沉淀一起加入离心柱中，12,000r/min离心60s，弃去滤液。 （7）加入500μl WB5，12,000r/min离心1min，弃掉滤液。 （8）重复第七步。 （9）室温12,000r/min离心60s彻底去除残留乙醇，并在室温下晾干离心柱。 （10）将离心柱转入一个新的1.5ml EP管，并向离心柱中央加20μl RNase-free Water，室温静置60s。 （11）室温12,000r/min 离心1min，洗脱DNA。 （12）将回收产物放置于-20°C保存。 . gE基因目的片段的PCR扩增 PCR反应扩增目的基因，反应体系如下： ddH2O 80μ