健康食品之護肝功能(針對化學性肝損傷)評估方法.docVIP

健康食品之抗氧化功能評估方法(草案) 壹、前言 抗氧化性之評估，雖尚無一套公認的方法，但一般可分為體外及體內試驗，體內試驗較具說服力與代表性，其所耗的時間及成本皆高於體外試驗。因此欲評估樣品是否有抗氧化性應先從體外試驗著手，有良好的抗氧化性再進行體內試驗，如此應較可節省時間與成本。 貳、實驗項目及方法 一、實驗項目： (一)活體外試驗： 1.抗氧化能力之測定： (1)過氧化抑制率：Ferric thiocyanate法 (2)共軛雙烯：Conjugated diene法 (3)微脂粒氧化作用之抑制：TBARS法 (4)Trolox當量的抗氧化能力：TEAC 法 2.清除自由基、活性氧及螯合鐵能力之測定： 清除(，(-diphenyl-(-picrylhydrazyl （DPPH）自由基(DPPH()、氫氧自由基((OH)、超氧陰離子(O2(-)、過氧化氫(H2O2)及螯合金屬離子能力。 (二)活體內試驗： 可分為動物及人體試驗，動物試驗包括組織及血液試驗；而人體試驗則僅需進行血液試驗，兩者皆以檢測過氧化脂質產物(如malondialdehyde，簡thiobarbituric acid reacting substance，簡ascorbic acid之效果，以評估抗氧化功能。另外在動物試驗對抗氧化評估試驗，應需添加誘發劑如金屬離子、H2O2或其他氧化劑以利實驗的進行。將所得的數據以Statistical Analysis System (SAS)進行統計分析，以ANOVA 程序做變異分析，並以Duncan’s Multiple Range Ｔests做顯著性差異比較，以評估樣品是否真正具有抗氧化功能。 二、實驗方法： (一)活體外試驗 (In vitro) 1.抗氧化能力之測定 (1)氫過氧化物之測定(POV; Ferric thiocyanate 法) (原理 抑制過氧化率之測定是採用硫氰酸鐵法(ferric thiocyanate method)，以評估抗氧化劑之抗氧化性，其原理是利用脂質氧化初期生成高能的氫過氧化物，將Fe2+氧化成Fe3+，Fe3+又會與SCN-反應而生成紅色的硫氰酸鐵錯合物[Fe(SCN)63-]，此錯合物於500 nm波長有最大吸收波峰。其反應如下: ROOH + Fe2+ →ROH + HO. + Fe3+ Fe3++ 6NH4SCN→Fe(SCN)63- + 6NH4+ 當脂質氧化程度越高，氫過氧化物亦生成越多，呈色也跟著加深。因此，藉由測量500 nm波長處的吸光值大小，便可得知樣品的抗氧化性。 (試藥與儀器 儀器：分光光度計、保溫箱 試藥：0.02 M linoleic acid 0.2 M potassium phosphate buffer (pH 7.0) 75% ethanol 30% ammonium thiocyanate 0.02 M iron(Ⅱ) chloride tetrahydrate (樣品處理 樣品可以是純品、粗萃取物或乾燥粉末，要做此試驗前，需先使此樣品完全溶解於水、酒精、DMSO或其他溶劑，若有不溶現象，需再經離心或過濾的處理，使樣品成均勻狀態的測液。 0.02 M之linoleic acid emulsion 2.5 ml，各加入不同濃度樣品及0.2 M potassium phosphate buffer (pH 7.0) 2 ml。混勻後置於37℃，每隔一段時間取出，依ferric thiocyanate方法測定其過氧化物。取上述之樣品混合液0.1 ml，分別依序加入75%之乙醇溶液4.7 ml，30% ammonium thiocyanate 0.1 ml及0.02 M iron(Ⅱ) chloride tetrahydrate 溶液0.1 ml，振盪使其混合均勻。靜置3分鐘後，以分光光度計測其在500 nm波長下之吸光值。 * Linoleic acid emulsion (pH 7.0) 之配置： 50 ml 之0.2 Mphosphate buffer (pH 7.0)加入0.2804 g之linoleic acid及0.2804 g 之Tween 20，以均質機均質成乳化液即可。此乳化液愈新鮮配製愈佳。 (結果判定 由吸光值判定，吸光值愈低者，表示測試樣品之抗氧化能力愈強。或以抑制過氧化百分比表示，即抑制率愈高抗氧化效果愈佳。 (Inhibition of peroxidation %, IP%) (抑制亞麻油酸過氧化物形成的能力) = [1－(樣品於500 nm的吸光值) / (未添加樣品之控制組於 500 nm的吸光值)]×100。 抑制脂質過氧化率(%)愈高表抗氧化性愈強。 (2)共軛雙烯