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实验十　 血糖的测定 血液中的葡萄糖称血糖。正常人血糖浓度较恒定，维持在3．9mmol／L～6．1mmol／L之间。血糖浓度的相对恒定是机体进行正常生理活动的前提条件之一，有着双重实际意义：其一，维持稳定的能源供给，满足机体在各种生理状态下对能量的需求。其二，保证机体不因进食致血糖浓度过高，导致糖的丢失。因此，血糖的测定是临床生化检验实验室的常规检测项目。血糖测定按其发展过程及反应原理的不同，大致分三类：氧化还原法 ，缩合法（主要有邻甲苯胺法），酶法（主要有己糖激酶法和葡萄糖氧化酶法）。葡萄糖氧化酶 (glucose oxidase，GOD) 将葡萄糖氧化为葡萄糖酸过氧化氢。过氧化物酶 (peroxidase，POD)将，即 Trinder 反应 【器材】 试管、吸管、试管架、恒温水浴箱、分光光度计 【试剂】 　1. 0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.0）　 称取无水磷酸氢二钠8.67g及无水磷酸二氢钾5.3g溶于800ml蒸馏水中，用1mol/L氢氧化钠（或1mol/L盐酸）调节pH至7.0，然后用蒸馏水稀释至1L。 　2. 酶试剂　 称取过氧化物酶1200U，葡萄糖氧化酶1200U，4-氨基安替比林10mg，叠氮钠100mg，溶于上述磷酸盐缓冲液80ml中，用1mol/L NaOH调pH至7.0，加磷酸缓冲液至100ml。置冰箱保存，4℃可稳定3个月。 　3. 酚溶液　 称取重蒸馏酚100mg溶于100ml蒸馏水中（酚在空气中易氧化成红色，可先配成500g/L的溶液，贮存于棕色瓶中，用时稀释），用棕色瓶贮存。 　4. 酶酚混合试剂　 取上述酶试剂与酚溶液等量混合，4℃可以存放一个月。 　5. 12mmol/L苯甲酸溶液　 溶解苯甲酸1.4g于蒸馏水约800ml中，加温助溶，冷却后加蒸馏水至1L。 6．葡萄糖标准贮存液100mmol/L） 称取已干燥恒重的无水葡萄糖1.802g，溶于12mmol/L苯甲酸溶液约70ml中，以12mmol/L苯甲酸溶液100ml。7.葡萄糖标准应用液5mmol/L） 吸取葡萄糖标准贮存液5.0ml 于100ml 容量瓶中，12mmol/L 苯甲酸溶液至刻度。 取3 支试管，按下表操作。 加入物 (ml)空白管 标准管 测定管 血清－ － 0.02 葡萄糖标准液 － 0.02 － 蒸馏水 0.02 － － 酶酚混合3.0 3.0 3.0 混匀，置 37 水浴中保温 ，在波长 505nm 处比色，以空白管调零，读取标准管及测定管吸光度。 血糖（mmol/L）= ×5 ? 标准管吸光度 【注意事项1．测定结果如超过20mmol／L，应将标本用生理盐水稀释后再测定，结果乘以稀释倍数。 2．若酶酚混合试剂呈红色，应弃之重配。因标本和标准用量少，其加量是否准确对测定结果影响较大，故其加量必须准确。3．GOD-POD法的第一步反应特异性高，而由POD催化的第二步指示反应是非特异性的，易受标本中尿酸、维生素C、谷胱甘肽、胆红素等还原物的干扰，这些物质与色素原竞争H202，使测定结果偏低。4．Trinder反应由Trinder于1969年提出。后经许多学者改进，采用2，4-二氯酚、2-羟-3，5-二氯苯磺酸等代替苯酚，由于这些化合物氧化生成的色素的摩尔吸光系数均高于苯酚，使反应灵敏度得以提高。可见摄入高糖食或紧张肾上腺分泌增加时。 甲状腺功能亢进肾上腺皮质功能及髓质功能亢进α-细胞瘤等。 　⑶颅内压增高：颅内压增高（如颅外伤、颅内出血、脑膜炎等）刺激血糖中枢，出现高血糖。 　⑷脱水引起的高血糖：如呕吐、腹泻和高热等也可使血糖轻度增高。 　3. 生理性低血糖 饥饿或剧烈运动、注射胰岛素或口服降血糖药过量。 　4. 病理性低血糖 　⑴胰岛素分泌过多：由胰岛β细胞增生或胰岛β细胞瘤等引起。 　⑵对抗胰岛素的激素分泌不足：如腺垂体功能减退、肾上腺皮质功能减退和甲状腺功能减退等。 　⑶严重肝病患者：肝贮存糖原及糖异生功能低下，不能有效调节血糖。 【结果及分析】 【思考题】 1. 血糖有哪些来源和去路，机体是如何调节血糖浓度恒定的？ 　　2. 酶试剂为什么要用磷酸缓冲液配制，用蒸馏水是否可以，为什么？ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 二、邻甲苯胺法 【目的】 了解测定血糖的原理和方法，要求在实验中培养学生严谨的作风和准确地进行实际操作的能力。 【原理】 葡萄糖在热的醋酸溶液中与邻甲苯胺缩合生成葡萄糖邻甲苯胺，后者脱水生成雪夫（Schiff）碱，再经结构重排，生成有色化合物。颜色的深浅与葡萄糖含量成正比。其反应式如下： 葡萄糖