酶工程4-(9-10)结晶干燥精讲.pptVIP

一、影响酶的结晶的因素 1）纯度：酶的结晶并非达到绝对纯化,只是达到相当的纯度而已。 不同的酶对结晶时的纯度要求不同，通常酶的纯度在50%以上,方能进行结晶。 为了获得更纯的酶,一般要经过多次重结晶。 2）浓度：以结晶时酶液浓度应当控制在介稳区,即酶浓度处于稍微过饱和的状态。 酶在结晶时,酶液应达到一定的浓度。浓度过高时,会形成许多小晶核,结晶小,不易长大。 3）其它：结晶过程中还要控制好温度、pH值、离子强度等结晶条件，才能得到结构完整,大小均一的晶体。 二、常用的酶结晶法 1.盐析结晶法 是指在适当的温度和pH值等条件下, 于接近饱和的酶液中缓慢增加某种中性盐的浓度, 使酶的溶解度慢慢降低, 达到稍微过饱和状态, 而析出酶晶体的过程。 中性盐：通常采用的是硫酸铵 操作：一般是把饱和盐溶液慢慢滴加到浓酶液中,在稍微呈现混浊时,让其在一定温度条件下(通常在0～10℃)放置一段时间,慢慢析出结晶。再缓慢而又均匀地补加少量饱和盐溶液,直至结晶完全。 盐析结晶还可以采用抽提法。 抽提法结晶 即将酶液先经过硫酸铵盐析得到酶的沉淀, 再用较高饱和度的冰冷的硫酸铵溶液抽提, 使一部分酶溶解, 分离得到的上清液在室温下放置一段时间, 慢慢析出酶结晶。剩下的沉淀依次用较低饱和度的冰冷硫酸铵溶液抽提。 由于低温时酶在硫酸铵溶液中的溶解度较高, 温度升高时酶的溶解度降低, 所以用冰冷的硫酸铵溶液抽提后, 抽提液在室温下放置时, 随着温度的升高, 会慢慢析出结晶。 首次抽提所使用的硫酸铵溶液的饱和度应稍高于酶盐析沉淀时硫酸铵饱和度的上限。 2.有机溶剂结晶法 概念：是在接近饱和的酶液中慢慢加入某种有机溶剂,使酶的溶解度降低,而析出酶晶体的过程。 操作：首先要将经过纯化的酶液浓缩至接近饱和状态,将酶液的pH值调节到酶稳定性较好的范围,用冰浴降温至0℃左右。然后一边搅拌一边慢慢加入有机溶剂,当酶液稍微出现混浊时,将其在冰箱中放置1～2h,离心除去沉淀。再将上清液置于冰箱中,让其慢慢析出结晶。 常用试剂：乙醇、丙酮、丁醇、甲醇、异丙醇、甲基戊二醇、二甲亚砜等。 优缺点：含盐少, 结晶时间较短。但操作要在低温条件下进行, 以免引起酶的变性失活。 3. 透析平衡结晶法 概念：是将酶液装进透析袋, 对一定浓度的盐溶液进行透析,使酶液逐步达到过饱和状态而析出结晶的过程。 操作前提： 酶液要达到一定纯度（经过纯化）。 酶液要浓缩到一定浓度（减少透析时间）。 应用：少量和大量样品的结晶。 例如：过氧化氢酶,己糖激酶、亮氨酰tRNA合成酶、羊胰蛋白酶等都采用此法得到结晶。 4.等电点结晶法 概念：是通过缓慢改变浓酶液的pH值, 使之逐渐达到酶的等电点, 而使酶析出结晶的过程。 操作：调节酶液的pH值是一定要缓慢而且均匀, 以免引起局部过酸或者过碱而影响结晶。 分类： 透析平衡等电点结晶法 气相扩散等电点结晶法 温度差结晶法 金属离子复合结晶 透析平衡等电点结晶法：将浓酶液装在透析袋中,对一定pH值的缓冲溶液进行透析,使酶液的p H 值慢慢改变,逐渐接近酶的等电点,而使酶结晶析出。 气相扩散等电点结晶法：将酶液装在容器中,与装有挥发性酸或挥发性碱的容器一起置于一个较大的密闭容器中,挥发性酸(如乙酸、干冰等)或挥发性碱(如氨水等)先挥发到气相中,再慢慢溶解到酶液中,使酶液的pH值慢慢接近酶的等电点而结晶析出。 温度差结晶法：利用酶在不同的温度条件下溶解度不同的特性,通过改变温度使酶的浓度达到过饱和状态而结晶析出。 金属离子复合结晶：在酶液中加进某些金属离子, 使之与酶结合生成复合物而结晶析出。 第十节 浓缩与干燥 一、浓缩 是从低浓度酶液中除去部分水或其他溶剂而成为高浓度酶液的过程。 浓缩的方法很多。离心分离、过滤与膜分离、沉淀分离、层析分离等都能起到浓缩作用。用各种吸水剂, 如硅胶、聚乙二醇、干燥凝胶等吸去水分, 也可以达到浓缩效果。 （一）蒸发浓缩 通过加热或者减压方法使溶液中的部分溶剂汽化蒸发, 使溶液得以浓缩的过程。（真空浓缩，使温度60oC, 防止酶失活） 二、干燥 概念：是将固体、半固体或浓缩液中的水分或其他溶剂除去一部分, 以获得含水分较少的固体物质的过程。 物质经过干燥以后, 可以提高产品的稳定性, 有利于产品的保存、运输和使用。 干燥速率： 干燥速度与蒸发表面积成正比。 提高方法：升高温度、降低压力、加快空气流通 范围合适：干燥速度过快时, 表面水分迅速蒸发, 可能使物料表面粘结形成一层硬壳, 妨碍内部水分子扩散到表面,