用滴管灌胶.ppt

* /department/biochemistry * 中山医学院 /department/biochemistry 分子医学实用技术 蔡卫斌 生 物 化 学 教 研 室 ?4 ? caiwb@ 生物化学与分子生物学教研室 生化与分子生物学技术 中山医学院 生物化学与分子生物学教研室 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 一、 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 实验操作及注意事项 实验分组（每人做一管，每组配一份胶） ?认清试剂（试剂和吸管对号、量器的使用） ? 封管 ? 分离胶配制与灌胶（浓度为6%，化学聚合，每组总体积为10ml，灌胶高度为7~8cm） 封正丁醇3mm（手法、高度、观察界面变化和判断凝固、时间掌握25min） 注意事项： 1、封管要严，防止漏液。 2、固定玻璃管要竖直，防止夹碎。 3、每组配一份胶，试剂与移液管对号，准确加量。 4、配胶后立即灌胶（用滴管灌胶，用后立即清洗） 5、正丁醇沿管壁缓缓加入 浓缩胶配制（浓度为3%，光聚合，每组总体积为8ml，灌胶高度为1.5cm,留1cm空隙加样） ? 倒掉正丁醇 灌浓缩胶 ? 封正丁醇3mm（观察界面，判断凝固时间） ? 安装电泳槽（结构、原理、电流及电极的方向、不漏水、除气泡） 注意事项： 1、倒掉正丁醇，用滤纸吸干再灌浓缩胶。 2、配胶后立即灌胶（用滴管） 3、灌胶后立即清洗滴管，防止胶凝固于管中。 4、撕掉封口膜，用胶塞将玻璃管固定于电泳槽上（竖直，防漏） 5、加电极缓冲液（注意液面） 加buffer?样品处理并加样（20ul）?电泳（6mA/管，距底1cm时停止）剥 胶  固定（时间5min） 染色（时间2min） 漂洗脱色至背景透亮 二、电泳基本原理及相关知识 电泳的概念 带电粒子（胶体颗粒、离子等）在电场的作用下在特定的介质中向与其电荷性质相反的电极方向定向泳动的现象。 广泛应用于生物大分子的分离和鉴定 电泳的基本原理 利用物质的两个差异来分离物质 电荷差异 电荷性质 电荷数量 分子差异 分子大小 分子形状 电泳分离蛋白质的原理 ? 蛋白质两性解离与等电点 ? 溶液pH与蛋白质PI决定蛋白质电荷性质与数量 ? 不同蛋白质分子大小和分子形状的差异 ? 实验室中常用到的电泳方法 （以介质分类） ? 纸电泳 ? 醋酸纤维膜电泳 ? 凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 原 理 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(N，N—methylene-bisacylamide，简称Bis)在加速剂N，N，N?，N?—四甲基乙二胺(N，N，N?，N?—tetramethyl ethylenedia mine，简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(ammonium persulfate (NH4)2S2O8，简称AP)或核黄素(ribofavin即vita min B2，C17H20O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)。 聚丙烯酰胺凝胶有下列特性： (1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好； (2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶； (3)对pH和温度变化较稳定； (4)几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好； (5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g (6)凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径； (7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。 凝胶浓度(T)的选择与被分离物质分子量密切相关。 分子量范围与凝胶浓度的关系 分子量范围 适用的凝胶浓度/(%) 蛋 白 质 ?104 20-30 1-4×104