高级生化-离子交换分离解说.pptVIP

* 2. 离子交换色谱(ion exchange chromatography,IEC） * 2.1 原理： ——生物大分子电荷性不同，与离子交换层析介质的离子基团间的作用力强弱也存在差异；当使用高浓度盐溶液进行洗脱时，与离子交换层析介质结合力弱的待分离分子先被洗脱下来，而结合力强的分子后被洗脱下来，从而达到分离纯化的目的。 优点：? ——离子交换层析的处理量大、操作简单、价格低廉、纯化后的生物大分子能很好地保持生物学活性，因此广泛应用于生物大分子的分离纯化工作中。 * 2.2 离子交换剂组成 阴离子交换剂： ——固定相基团带正电荷的时候，其可交换离子为阴离子，如一N(CH3)OH(强碱型)或NH3OH(弱碱型)，可解离出OH－， 阳离子交换剂： ——其可用来与流动相交换的离子为阳离子，功能团主要是－SO3H及－COOH。 离子交换色谱主要用于可电离化合物的分离，例如，氨基酸自动分析仪中的色谱柱，多肽的分离、蛋白质的分离，核苷酸、核苷和各种碱基的分离等。 * 离子交换剂应满足的基本条件有: ①有高度的不溶性.即在各种溶剂中不发生溶解;②有疏松的多孔结构或巨大的表面积,使交换离子能在交换剂中进行自由扩散和交换;③有较多的交换基团;④ 有稳定的物理化学性质.在使用过程中,不因物理或化学因子的变化而发生分解和变形等现象. * 阴离子交换剂： ——固定相基团带正电荷的时候，其可交换离子为阴离子，如一N(CH3)OH(强碱型)或NH3OH(弱碱型)，可解离出OH－， 阳离子交换剂： ——其可用来与流动相交换的离子为阳离子，功能团主要是－SO3H及－COOH。 离子交换色谱主要用于可电离化合物的分离，例如，氨基酸自动分析仪中的色谱柱，多肽的分离、蛋白质的分离，核苷酸、核苷和各种碱基的分离等。 * 离子交换剂的特性： 1. 疏水性离子交换剂 疏水性离子交换剂中的基质是人工合成的,与水结合力较小的树脂.常用的树脂是由苯乙烯和二乙烯苯合成的聚合物,其中二乙烯苯是交联剂,能把聚乙烯苯直链化合物连接成类似海绵状的结构,在此结构中以共价键引入不同的电荷基团.离子交换树脂以电荷基团的性质分则有:阳离子交换树脂,阴离子交换树脂(分别包括强,中,弱三种电荷基团)和螯合离子交换树脂(对金属离子有较强的选择性).  * (1) 阳离子交换剂 阳离子交换剂的电荷基团带负电,反离子带正电.因此,可以与溶液中的正电荷化合物或阳离子进行交换反应.根据电荷基团的强弱,又可将阳离子交换剂分为强酸型( 带磺酸基团),中强酸型(带磷酸基团或亚磷酸基团)和弱酸型(带羧基的或酚基)三种.  (2) 阴离子交换剂 阴离子交换剂是在树脂中分别引入季胺〔-N(CH3)3〕,叔胺〔-N(CH3)2〕,仲胺〔 -NHCH3〕和伯胺〔-NH2〕基团构成的.当引入季胺和叔胺基团时,分别为强阴性和中强阴性离子交换剂.当引入仲胺和伯胺基团时,为弱阴性离子交换剂. 树脂型离子交换剂一般都呈网络结构的珠状体,其大小在20-50目之间.近年Bio-Rad公司还制造了50-100目,100-200目以及200-400目的产品,目数大的树脂对提高分辨率和交换容量是有利的. * 疏水性的离子交换剂由于含有大量的活性基团,交换容量高,机械强度大,流动速度快. 因此,主要用于分离无机离子,有机酸,核苷,核苷酸和氨基酸等小分子物质, 其次可用于从蛋白质溶液中除去表面活性剂(如十二烷基硫酸钠),清洁剂(如tritonX-100),尿素,两性电解质(Ampholyte). 此外,还可用于分离某些不易变性的蛋白质. 疏水性的离子交换剂对带电荷多和疏水性强的被分离物有较强的截留能力.阳离子交换树脂对氨基酸的分离 * 2.亲水性离子交换剂 这类交换剂与水的亲和力较大,载体孔径大,适合于分离生物大分子,有多种类型:  (1) 纤维素离子交换型 以纤维素为基质,常用的功能基因有 磷酸基(P.中强酸型), 磺酸乙基(SE,强酸型), 羧甲基(CM,弱酸型), 三乙基氨基乙基(TEAE,强碱型), 二乙氨基乙基(DEAE,弱碱型), 氨基乙基(AE,中等碱型), 三乙醇基氨基(ECTE,中等碱型)等, 可制成纤维状,微粒,短纤维,球形四种类型, * Pharmacia (GE)公司生产的DEAE-Sephacel为球形颗粒,机械性能和理化稳定性好,对蛋白质,核酸,激素等均有良好的分辨率,回收率和交换容量,使用简单方便,在生物化学与分子生物学中使用普遍.此外,Watman公司的DE-,CM-,P- ,AE-,SE-及QA-纤维素,Bio-Rad公司的CellexD,CellexE,CellexP和CellexCM,