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临床荧光PCR标本采集、运送、保存及处理 中国人民解放军第三0二医院王海滨 一、临床常遇到的标本类型 血清（浆）、全血、外周血单个核细胞、痰（检测结核、 HBV 等）、棉拭子（咽拭子或肛拭子，如 H1N1 、 H7N9 ）、脓液、体液（胸、腹水，精液，引导分泌物等）、乳汁（处理）、组织细胞（定量的相对性、 HPV 取样）。 二、标本采集 标本采集时间对 PCR 检测结果的影响：需早晨空腹采集，早上血液里面的成分比较稳定。下午采集的标本不能反应病人机体的基础状况。标本的类型和采集量：标本量需依据检验方法的差异，如罗氏 COBAS 方法，需要的标本量是血浆 1ml 。采样质量的评价：与其他检查项目相同，输液部位抽血的错误做法等。采样及运输容器：关于低温保存的误区，夏季异地运输需冷运。标本间的交叉污染： 交叉污染对生化检测影响不大，但对免疫或 分子的检测影响比较大。 样本一经采集，则应尽可能快的送至检测实验室。对临床检验使用的样本，原则上不需要加任何防腐剂或稳定剂。所加入的任何物质均有可能成为 PCR 的干扰物质。特别是一些质控品。实验室应根据待测靶核酸的特性，对各种临床样本的运送条件作出相应的规定。低温保存和运输对 RNA 的检测似有必要。冻干质控样品更稳定，易于保存运输。 （一）血清（浆） 无论是血浆还是血清，采集后尽可能做到及时离心使细胞分离。血液采集后室温放置半小时，血液凝固后就可以分离血清。 进行不同的检测时，血清或血浆需要保存的温度不同： DNA 测定：血清或血浆分离后封闭保存在 2-8 度，长期稳定。但要避免溶血引起的干扰。 RNA 测定：血清或血浆分离后封闭保存在 2-8 ℃ ，一个月内基本稳定。但要避免溶血引起的干扰。 以上标本长期保存尽可能在 -20 ℃ 下，反复冻熔对结果影响不大。有文献提出，检测 HIV 的标本，需在 -70 ℃长期保存，但 没有条件的单位未必非要求保存在 -70 ℃ 。 1. 标本和核酸不同保存条件稳定性实验 PPT6 显示的是标本和核酸在不同保存条件下稳定性的实验，分为两组，一组是标本，另一组是纯化后的核酸。 1 ）血清标本的保存条件：室温、冷藏、冷冻、 -70°C 。 大家可以看到，在室温条件下，血清标本第一天和第七天，检测结果没有明显的变化，第十四天开始下降，第二十一天已完全降解。 4°C 保存，及冷藏、冷冻保存并反复冻融的血清标本，可以保存 28 天。 2 ）纯化后的核酸保存条件：室温、冷藏、冷冻、 -70°C 。 提取后的核酸，放在室温、冷藏、冷冻甚至是 -70°C 。这里把室温、冷藏、还有反复冻融这三个数据拿来比较，可以看到，一个月之内结果的稳定性，三者是重合的。 2. 全血（或 PBMC ）细胞（细胞内病毒）核酸提取 以全血作为待测标本时，必须注意抗凝剂的选择，一般使用 EDTA-Na 2 或枸椽酸钠，不可使用肝素。全血样本如用于 DNA 提取检测，可 4 ℃ 下短期保存，如用于 RNA 检测，则应在取血后，尽快提取 RNA 。 外周血单个核细胞的分离： 1 ）使用淋巴细胞分离液分离制备； 2 ）使用红细胞裂解液（冰水），裂解全血中的红细胞，经生理盐水洗涤，即可得到单个核细胞。 外周血单个核细胞如暂不提取核酸，可保存于 -20 ℃ 下。 （二）痰 痰属于分泌物，临床上常用作为结核杆菌 DNA 测定标本。痰标本中含有大量粘蛋白和杂质，故在核酸提取时，需对样本进行初步处理，即用 1mol/LNaOH 或变性剂液化。如用于非结核杆菌如肺炎支原体的 PCR 检测，痰标本只能室温悬浮于生理盐水中，充分振荡混匀，促使大块粘状物下沉，取上清离心，所得到的沉淀物即可用于核酸提取。液化标本如不立即用于核酸提取，可保存于 -20 ℃ 。 痰标本处理通用模式： （ 1 ）通用标本处理（ Universalsampleprocessing ， USP ）溶液： 4-6mol/L 盐酸胍（ GuHCl ）； 50mmol/LTris-HCl ， pH7.5 ； 25mmol/LEDTA ； 0.5%Sarkosyl ； 0.1~0.2mol/Lβ- 巯基乙醇。 （ 2 ） 0.05%Tween80 。 （ 3 ） 10%Chelex-100( 含 0.03%TritonX-100 和 0.3%Tween20) 。 （三）棉拭子 在使用 PCR 方法检测性病病原体时，临床标本一般为棉拭子，如咽拭子、肛拭子。可将棉拭子置于适量生理盐水中，充分震荡洗涤后，室温静置 5 ～ 10 分钟，待大块状物下沉后，取上清立即离心，其后的沉淀即可用于 DNA 提取。 如不立即用于核酸提取，则需保存于 -20 ℃ 下。 标本采集质量和处理质量对检