碱性蛋白酶高产菌株的筛选鉴定及发酵条件优化精讲.doc

碱性蛋白酶高产菌株的筛选鉴定及发酵条件优化 摘要 通过测量比较牛奶平板上透明圈的大小，从土壤中筛选出一株高产碱性蛋白酶的菌株BP-10，通过产碱性菌株生理生化试验，16S rDNA序列鉴定为专性嗜碱性芽孢杆菌Bacillus pseudofirmus。然后从酶活为26.34U/ml的10号菌株（BP-10）出发，确定了其最佳碳源是葡萄糖，最佳氮源是蛋白胨，在培养36h后达到最大酶活为193.39U/ml，比优化前提高了7.34倍。 关键词 碱性蛋白酶 筛选鉴定 培养 发酵优化 碱性蛋白酶(Alkaline Protease)是一类适宜于在碱性条件下水解蛋白质肽键的酶类，广泛存在于动、植物及微生物生物体中,在猪的胰脏中最早被发现【1】【2】。1945年瑞士Dr Jaag等人在地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)中发现了碱性蛋白酶【3】。碱性蛋白酶作为工业催化剂已广泛应用于制革、银回收、医药、食品加工、饲料、化学工业、废物处理等行业,尤其是作为无磷洗衣粉的添加剂应用广泛【4】，目前碱性蛋白酶的销售量大约占全世界每年总销售量的30%左右【5】pH和温度范围内保持较高的酶活力和稳定性,同时还必须与含有多种氧化剂、鳌合剂和表面活性剂的洗衣粉相融合。目前,在工业应用中的很多碱性蛋白酶存在弊端,例如在表面活性剂、氧化剂、热稳定性、酸碱稳定性方面及培养基成本较高等【6】【7】。因此,筛选新的高产碱性蛋白酶菌株和对其产碱性蛋白酶的酶学条件研究具有重要的理论意义和应用价值，同时利用基因工程手段进行改造将是以后研究的重点方向。本实验从土壤中筛选出若干产碱性蛋白酶的菌株并摸索了其酶学性质及产酶的最始条件，为后期改造菌种提供了基础。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 土样来源 河南工业大学的花园、树林 1.1.2 培养基【8】 牛奶培养基：酵母粉0.5g、琼脂粉2g、脱脂奶2g及0.1mol/LNa2CO3-NaHCO3缓冲液pH10.0、蒸馏水100ml。 种子培养基：酵母粉0.5g、胰蛋白胨0.5g、葡萄糖1g、K2HPO4 1.8g、100ml。 基本发酵培养基:葡萄糖1.00g、酵母粉1.00g、K2HPO40.1g、干酪素0.10g、氯化钠1.00g及0.1mol/LNa2CO3-NaHCO3缓冲液(pH10)100ml溶解。 以上培养基均在121℃下灭菌20min 1.1.3 主要试剂 干酪素、三氯乙酸、酪氨酸、福林试剂、硼砂、葡萄糖、酵母粉、胰蛋白胨及其他试剂均为市售分析纯；所用到的分子试剂均购于上海生工生物工程有限公司。 1.2 方法 1.2.1 产碱性蛋白酶菌株的筛选 初筛 称土样l0g于装有90mL无菌水的三角瓶内，振荡，静置，吸取0.1ml菌悬液于另一个装有0.9ml无菌水的1.5ml的离心管内，振荡均匀，既得10-1的稀释液，然后以此方法继续稀释得到10-2、10-3的稀释液。吸取0.2ml稀释菌液（10-1、10-2、10-3）涂布于牛奶平板培养基中，30℃恒温培养24h~48h后，根据透明圈的有无，挑取透明圈直径较大的菌落，进行分离纯化、斜面保藏。 复筛 将初筛的菌株经斜面活化后接种于种子培养基中，30℃、200rpm12h，按2%的接种量接入50mL发酵培养基中，30℃、200rpm48h，10000rpm离心5min，取上清液测定蛋白酶活力。 1.2.2 碱性蛋白酶活力测定 按轻工业部颁标准QB/T 1803-93：Folin试剂显色法【9】。规定将lml酶液在40℃、pH10.5，每分钟水解酪蛋白产生lμg酪氨酸所需的酶量定义为1个酶活力单位（U/ml）。 1.2.3 菌株16S rDNA序列鉴定 菌株16S rDNA序列由上海生工公司测序DNA小量纯化试剂盒提取细菌基因组DNA，PCR所用引物为： 16S-F:5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-316S-R:5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3。50μLPCR反应体系：2×Taq Master Mix 25μL，上下游引物各2μL，模板DNA1μL，无菌去离子水补充至50μl；程序：95℃，5min；95℃，30s；50℃，30s；72℃，2min；72℃，10min；30个反应循环。产物经琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收测序。登录GenBank数据库，同相关菌株比对，确定筛选出的菌种。 1.2.4 不同碳源对产酶的影响 分别配制四种用蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、淀粉作为唯一碳源的发酵培养基（pH10），其他条件保持一致，将四种培养基灭菌，37°C摇床培养24h，测定酶活,选定最佳碳源。 1.2.5 不同氮源对产酶的影响 分别配制