荧光法的应用解释.pptxVIP

荧光分析法的应用;荧光光谱法研究亚甲蓝与三种 芳香族氨基酸的相互作用 荧光分析法测定肉类食品中诺氟沙星的残留 ;荧光光谱法研究亚甲蓝与三种芳香族氨基酸的相互作用;溶液配制： 配制浓度为2×10-4mol/L 的MB储备液；Trp、Tyr和Phe储备液的浓度分别为2×10-4mol/L、2×10-4mol/L 和2×10-3mol/L (2×10-3mol/L、2×10-3mol/L 和2×10-2mol/L )；配制0.02mol/L 的pH 7.4 Tris-HCl缓冲溶液(含0.1mol/L 的NaCl以恒定的溶液离子强度)。光谱测定所需溶液均使用缓冲溶液稀释、定容。 荧光光谱测定： 分别恒定温度在298.15K和310.15K条件下，按实验需要，准确移取一定量的MB和各氨基酸标准溶液于10mL容量瓶，用pH7.4的Tris-HCI缓冲溶液定容，水浴恒温振荡1h，然后冷却至室温，置于1cm的石英比色皿中，设置荧光光谱仪的激发和发射光栅狭缝均为5nm，光电倍增管电压为700mV，扫描速度为300nm·min-1，在此条件下记录280nm～550nm范围内的荧光光谱。;结果与讨论;由图可见，Trp、Tyr和Phe的最大荧光发射波长分别为346、303nm和282nm，随着MB浓度递增，Trp、Tyr和Phe荧光强度均逐渐降低，荧光光谱峰形保持不变，MB-Trp最大吸收位置红移约3nm，MB-Tyr红移约5nm，MB-Phe荧光峰蓝移约3nm。以上实验结果说明MB与Trp、MB与Tyr以及MB与Phe发生相互作用导致Trp、Tyr和Phe发生了荧光猝灭现象。 插图为荧光猝灭值(F0-F)对cMB(2×10-6～2.3×10-5mol/L )的线性拟合曲线，其中F0和F分别表示不加入和加入MB的荧光强度。相应回归方程的相关系数均在0.99以上，呈现很好的线性相关性，表明该法可用于痕量MB的测定。;二、亚甲蓝对三种芳香族氨基酸的荧光猝灭机理;结果显示，MB-Trp、MB-Tyr和MB-Phe作用过程中，随着温度升高Ksv减小，说明升高温度可能降低了复合物的稳定性，从而使猝灭常数下降。由此推断MB对Trp、Tyr和Phe均为静态猝灭作用。;Trp、Tyr和Phe的荧光寿命分别为3.1×10-9s、3.6×10-9s和6.8×10-9s。根据式(1)，由Ksv值计算得到Kq值及各线性回归方程相关系数R1 ，结果列于表1。表明，MB与上述三种氨基酸的线性拟合程度较好，且得到的Kq值均在1013数量级以上，远大于各种猝灭体对生物大分子的最大扩散猝灭常数2×1010L·mol-1·s-1，由此推断其荧光猝灭机制是由于MB与三种芳香族氨基酸均形成基态复合物而导致的静态猝灭过程，而非由扩散过程控制的动态猝灭过程 。;三、亚甲蓝与三种芳香族氨基酸的表观结合常 数Kc与结合位点数n;由图5线性拟合的截距和斜率，分别获得两温度下的Kc、n和线性回归系数R2，结果见表2：;四、亚甲蓝与三种芳香族氨基酸相互作用力类型的确定;由表3可看出：(I)MB-Trp反应过程中△ rHm0，为吸热反应，升高温度有利于复合物的生成，所以升高温度使结合常数增大，复合物稳定性增强；(2)MB-Tyr和MB-Phe反应过程的△ rHm 0，反应为放热反应，升高温度将不利于向着生成复合物的方向进行，故结合常数减小，生成复合物稳定性下降；(3)MB与三种芳香族氨基酸结合的△ rGm0，表明结合过程均是自发分子作用过程；(4)根据药物分子与生物大分子作用的有关热力学参数可以简单判定其相互作用类型。在MB-Trp作用过程中，△ rGm0，△ rHm0，△rSm 0，从热力学角度看，MB主要通过疏水作用与Trp发生结合反应；在MB-Tyr和MB-Phe结合过程中，△ rGm 0，△ rHm0，△rSm0，表明它们之间的相互作用主要是静电作用力。;结论;荧光分析法测定肉类食品中诺氟沙星的残留;样品前处理方法： 取2 g经绞碎的各种肉类食品，每次加入10mL pH=4的盐酸溶液超声提取三次，每次10min，各离心10 min(3000 r/min)，合并三次上清液，加入1mL的Al3+标准溶液，定容至50mL，待测。 测定方法： 于5 mI 的具塞刻度试管中配制NFLX -Al3+的最佳体系溶液，使体系溶液中Al3+浓度为2.0mmol·L-1 、pH=4.0，静置5 min，取试液置于1 cm×1 cm石英液池中，设置激发和发射单色仪狭缝宽度均为5 nm，扫描速度为1200 nm·min-1，利用荧光分析法测定。;结果与讨论 ;二、稳定性实验;四、Al3+浓度的影响;五、样品背景干扰情况;六、标准工作曲线和检出限;七、精密度实验;结论; 谢谢！