PA28α对食管鳞癌细胞增殖、凋亡与迁移的影响.pdf

摘要 PA28 Q对食管鳞癌细胞增殖、凋亡和迁移的影响 硕士研究生 蒋海丽 导 师 匦关方霞 郑州大学生命科学院 郑州 450001 摘要 蛋白酶体是一类多催化位点蛋白酶复合物，负责细胞内大部分蛋白质的降 解，受着多种复杂因素的调控，通过有目的的降解受损伤的或者错误折叠的蛋 白质进而调节整个细胞的尘命过程，使整个生命过程得以高效准确地完成，这 些过程包括细胞周期、细胞凋亡、DNA修复、信号转导和免疫应答等11]。研究 显示，蛋白酶体是一个多亚基蛋白水解复合物，在生物体内最普遍的蛋白酶体 形式为26s蛋白酶体，由20s核心颗粒与具有激活核心颗粒作用的蛋白酶体激 活因子组成12J。在蛋白酶体激活因子作用下，蛋白质底物进入20S核心颗粒的中 心水解部位被降解。目前，在生物体内主要发现了两大类重要的蛋白酶体激活 存在时即可与20S结合，形成PA280【一20S复合物，可以增大20S核心颗粒与多 种底物肽的结合能力，提高生物体降解蛋白质的最大反应速度【41。 食管癌是我国北方的恶性肿瘤之一【5】。由于它在早期很难诊断，并且带有很 强的转移能力，即使能够诊断出来，一般也已处于晚期。并且，食管癌的预后 情况差，容易复发，确诊后的病人5年生存率仅占5。10％【酬。目前治疗食管癌的 情况并不乐观，这种不乐观的情况促使了我们进一步了解食管鳞癌的发生发展 机制，为降低食管鳞癌的发生率和研发新的治疗食管癌的药物提供实验依据。 目前，大量研究发现多种人类恶性肿瘤中存在PA28异常表达现象。张林等 pJ发现了削2黝基因能够抑制胃癌细胞的生长、增殖，同时还能够影响其细胞 周期，对抑制胃癌细胞的恶性表现有一定的意义。Lenlaire等【8】采用蛋白质组学 摘要 方法检测到PA28a在正常卵巢上皮中定位和在癌细胞中定位不同，分别定位在 细胞核、细胞质，因此PA28n可以作为卵巢癌的潜在生物学标记。研究显示， 蛋白酶体的其他亚基可以作为肿瘤治疗的靶点。有研究表明在乳腺癌中PA28Y 有显著的上调现象，并且增强了癌细胞的迁移能力，被作为检测乳腺癌的一个 潜在的生理指标【9J。 本课题以蛋白酶体激活因子PA28Ⅱ为研究对象，分别从转录水平和蛋白水 的表达以及定位，并且进一步研究了PA280l对食管鳞癌细胞Ecal09增殖、凋亡 以及迁移能力的影响，为研究PA28旺在细胞内的生物学功能提供了实验依据。 本课题主要分为两个部分： 第一部分：从转录水平和蛋白水平检测PA28c【在正常食管上皮细胞Het．1A 和食管鳞癌细胞株Ecal09、Ec9706中的表达，分析它们的表达差异，并且观察 PA28n蛋白在三株细胞中的定位情况。 第二部分：研究PA28Ⅱ在食管鳞癌细胞发生发展中的作用。首先根据PA28Ⅱ 在三株细胞中的表达差异，设计沉默PA28G【表达的干扰片段，并对有效干扰片 段进行筛选。在IFN．v为阳性对照的情况下，用有效的干扰片段干扰PA28c【的 表达，观察PA28Q的表达情况，并检测PA28C【的沉默表达对食管鳞癌细胞Ecal09 增殖、凋亡和迁移能力的影响。 材料和方法 1。细胞株 保存。三株细胞均在含有10％胎牛血清的RPMI．1640细胞培养基中于37℃， 含5％c02的饱和湿度的细胞培养箱中培养。 2．PA28 Q在正常食管上皮细胞(Het一1A)与食管鳞癌细胞株 (Ecal09、EC9706)中表达以其定位 利用实时荧光定量PCR和West咖Blot分别从转录水平和蛋白水平检测 II 摘要 的定位。 3．s iRNA介导的PA28Q基因沉默对食管鳞癌细胞Ecal09增殖、 凋亡和迁移能力的影响 首先利用荧光显微观察筛选出最有效的干扰片段，确定最佳干扰浓度，随 后通过细胞转染的方法，沉默PA28c【蛋白在食管鳞癌细胞Ecal09中的表达。以 转染后24h的食管鳞癌细胞Ecal09为研究对象，以IFN．Y为阳性对照，分别用 Westem