匹诺塞林生物合成相关基因的克隆、功能鉴定和工程菌的构建.pdf

2．7．10密码子优化………………………………………………………………………………．26 2．7．1 1匹诺塞林工程菌的构建及发酵…………………………………………………………．26 第三章对香豆酸辅酶A连接酶功能鉴定………………………………………………27 引言……………………………………………………………………………………………………．27 3．1实验方法…………………………………………………………………………………………一27 3．1．I虎眼万年青转录组测序及序列分析………………………………………………………27 3．1．3表达载体构建………………………………………………………………………………28 3．1．4重组Osa4CL蛋白表达和检测……………………………………………………………28 3．1．5 Osa4CL蛋白酶功能鉴定…………………………………………………………………28 3．2实验结果…………………………………………………………………………………………～29 3．2．1生物信息学分析……………………………………………………………………………29 3．2．2重组蛋白的诱导表达检测…………………………………………………………………33 3．2．3 Osa4CL家族的功能鉴定…………………………………………………………………。34 3．3本章小结…………………………………………………………………………………………．．36 第四章查尔酮合酶和查尔酮异构酶的克隆、功能鉴定………………………………．37 引言……………………………………………………………………………………………………．37 4．1实验方法……………………………………………………………………………………………38 4．1．1 OsaCHS和OsaCHl克隆及表达载体的构建……………………………………………．38 4．1．3 OsaCHS蛋白家族酶功能鉴定……………………………………………………………．39 41．3．1酶促反应法………………………………………………………………………．39 4．1．3．2构建匹诺塞林工程菌法…………………………………………………………．40 4．1．4 OsaCHl蛋白酶功能鉴定…………………………………………………………………一43 4．2实验结果…………………………………………………………………………………………．．44 4．2．1 OsaC^心和OsaCHI生物信息学分析……………………………………………………．．44 4．2．2 4．2．3OsaCHS功能鉴定…………………………………………………………………………49 4．2．3．1体外酶促反应鉴定法……………………………………………………………．49 1 4．2．3．2构建工程菌法……………………………………………………………………．5 4．2．4 OsaCHl功能鉴定…………………………………………………………………………．．59 4．3本章小结………………………………………………………………．…………………………．60 第五章匹诺塞林工程菌的构建及优化…………………………………………………．62 引言…………………………………………………．…………………………………………．．………62 5．1实验方法………………．……………………………………．…．………………………………．……63 万方数据 5．1．1发酵产物定量……………………………………………………………………………一63 5．1．2关键酶物转选择和模块化组装…………………………………………………………．．63 5．1．2．1关键酶物种选择…………………………………………………………………．