第四章-基本分子生物学技术解答.ppt

基因剔除技术(gene knock out) 也称基因靶向(gene targeting)灭活，有目的去除动物体内某种基因的技术。 三、基因剔除技术 将灭活的基因放入胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES)中，使这一灭活基因通过同源重组取代原有的目的基因，筛选到基因已定点灭活的细胞后，通过显微注射将细胞注入小鼠囊胚中。细胞在小鼠囊胚中参与胚胎的发育，最终形成嵌合体小鼠。 操作方式 建立动物模型 ① 单基因决定疾病模型 基因剔除 获得性突变(gain-of-function mutation) ② 多基因决定疾病模型 四、基因转移和基因剔除在医学发展中的作用 疾病相关基因的克隆与鉴定Cloning and Identification of Disease Relative Genes 第 八 节 克隆疾病相关基因的策略 （一）功能性克隆(functional cloning) （二）定位克隆(positional cloning) 定义 从对一种致病基因的功能的了解出发，克隆该致病基因。 （一）功能性克隆 应用 生化机制已明确、基因表达产物较易得到部分纯化的遗传性疾病。 克隆方式 ① 利用特异性抗体筛选表达型cDNA文库； ② 根据已知的部分氨基酸序列合成寡核苷酸作探针，筛选cDNA文库。 功能互补试验 (functional complementation assay) 利用酵母系统从功能学角度鉴定致病基因。 利用酵母系统从功能学角度鉴定致病基因。 用不同人的DNA片段转化与人类遗传疾病具有类似表型的突变酵母，可以恢复(rescue)正常表型的片段中所含有的基因即可能为致病基因。这种实验称为功能互补试验 (functional complementation assay)。 （二）定位克隆 定义 从一种致病基因的染色体定位出发逐步缩小范围，最后克隆该基因。 系统的定位克隆工作 ① 遗传学分析(确定致病基因染色体定位) 交换分析、连锁不平衡分析 ② 分子生物学分析 染色体异常(缺失、易位等)分析、基因文库的筛选与基因克隆 * 也就是用于检测某一组织中特定mRNA的表达水平 * 聚偏氟二乙烯PVDF * 斑点杂交是不经过电泳，而将被检测的标本直接点在膜上，烘烤固定，用于杂交，这种方法耗时短，可做半定量检测，一张膜上可检测多个样本。 原位杂交：指组织切片或者细胞涂片直接用于杂交，先经特殊的处理使细胞的通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或者RNA杂交，因此原位杂交可以确定探针的互补序列在胞内的空间位置，这一点具有重要的生物学和病理学意义。 * ×× * 与传统的PCR反应相比，实时PCR技术在系统中增加了一对特殊的引物作为探针。此探针的5‘端有一个荧光报告分子R，3’端有一个荧光淬灭分子Q。在没有扩增反应时，探针分子保持完整，荧光报告分子和淬灭分子同时存在，此时没有荧光信号。当有扩增反应时，TaqDNA聚合酶会在沿链延伸的过程中，遇到与模板结合着的探针分子，其5‘—3’外切核酸酶活性将会将探针逐一切断，探针分子上的荧光报告分子和淬灭分子一旦分离，就会产生荧光信号，被检测系统检测接收，用于数据分析。 实现了定量检测 * 获取目的基因最直接的方法 * 文库质量最重要的指标容量，即得到的克隆数要足够多，如106，才能代表完整的生物信息。 * 基因检测分析，2. DNA序列分析 3. 基因突变检测及多态性分析 4.基因表达谱分析 二、DNA链末端合成终止法 目 录 DNA的Sanger测序法 读出模板互补序列 dNTP 凝胶电泳 较大片段 较小片段 ddGTP ddATP ddCTP ddTTP 反应混合物 Klenow酶 未知序列的单链DNA 读出待测序列 CTGACTTCGACAAAGAA 5′ 3′ 放射性标记的引物 TGTT A C T G ddG ddG ddG ddG GACTGAAGCTGTT 3′ 5′ CTGACTTCGACAA 5′ 3′ DNA自动测序 采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。 DNA自动测序结果举例 引物标记法测序(Dye Primer) 一个样本，4个反应。4个反应中引物序列相同，但分别标记有不同颜色的荧光。 + AmpliTaq FS enzyme dCTP, dATP, dGTP, dTTP ddATP (term