受体方法课程方案.ppt

受体概论之;二、受体研究的内容;三、受体与配基结合反应的基本特征;四、受体研究的意义;; * 从更深层次上看，受体和配给的结合属于研究蛋白质三维结构的重要内容，在分子生物学已进入后基因组时代的今天，这方面的研究有很重要的理论意义。;第一节 受体的放射配基结合分析;第一节 基本原理  ◆20世纪20年代末A.J.Clark发现药物效应与受体结合量呈正比且药物活性与受体亲和性有关。  ;◆提出占领理论：受体与配基以单分子相互作用（分子比1：1），结核反应是可逆的，亲和性相同，配基在结合和解离后不被代谢，也不与其它类型受体结合，受体与配基结合产生的生物效应的强度与受体被占领的量成正比，受体结合反应平衡后服从质量作用定律。 ;;受体放射配基结合分析法;125I标记放射性配基的制备（可查相关文献） 1 氯胺-T法，N-氯代甲苯磺酰胺钠盐 2 Iodogen法，商品名为氯甘脲 3 乳过氧化物酶法 4 偶联标记法，标记游离氨基;受体标本的制备 1 组织切片 新鲜组织冰冻切片--离体放射配基结合反应—常规超薄切片—电镜自显影 2 完整活细胞 悬浮细胞：加入放射性配基进行结合反应，反应结束后取少量细胞，测量放射性。;贴壁细胞：待细胞长到90%左右去掉培养基，换为配基结合反应的缓冲液，不作成悬液，直接向贴壁细胞中加入放射性配基进行结合反应。 反应结束后，用冰冷的缓冲液洗去多余的游离配基，然后收集细胞，测定放射性。;3 亚细胞组分的差速离心法分离 全过程在4°C下进行。 组织匀浆—上清液– 上清液– 上清液（核受体） （800-3500g，~15分钟）---（10000-30000g，20min）--（100000g，60min） 注意问题： ●除去内源性配基和蛋白水解酶 ●受体标本保存，-70°C保存 ●受体蛋白从从膜结构或核中溶脱成可溶性受体，洗涤或用溶脱buffer。;第二节 组织化学（histochemistry）技术 ;免疫组织化学（免疫细胞化学）是组织化学的一种，它是利用已知的特异性抗体或抗原（受体）能特异性结合的特点，通过化学反应使标记于结合后的特异性抗体上的显示剂，如酶、金属离子、同位素等，显示一定的颜色，并借助显微镜观察其颜色的变化，从而在抗原抗体结合部位确定组织、细胞结构的化学成份或化学性质。 ;图10 免疫组织化学原理模式图;图11 免疫组织化学（荧光素标记） 毛细血管内皮细胞呈vWF阳性 ;图12 免疫组织化学（辣根过氧化物酶标记） 胰岛B细胞呈胰岛素阳性;图13 免疫组织化学电镜图示上皮细胞膜MAM－6蛋白 （A 胶体金标记 B 辣根过氧化物酶标记）;图18 体外培养的平滑肌细胞 （免疫组织化学染色显示肌动蛋白）;近十年来，免疫组化技术发展很快，在现代医学的基础和临床研究中发挥着重要的作用，对疾病，尤其是对肿瘤的诊断、鉴别诊断及发病机理的研究提供了强有力的手段，但随着免疫组化标记物的增多和利用，原为特异的标记物并非绝对特异，而且出现交叉反应和异常表达的情况日益增多。故对免疫组化标记结果的意义不能绝对化，应在光镜观察组织形态的基础上，合理使用免疫组化技术，审慎判断其标记的意义。 ;免疫细胞化学的突出优点是： 　　 1. 高度的特异性 　　抗原抗体反应是特异性最强的反应之一，免疫细胞化学所用的抗体必须是特异性强的多价或单价抗体，具有高度的认别能力，在抗原识别上可达到单个氨基酸的水平，这是其它组织化学方法难以相比的。;　　2. 高度敏感性 　　现代免疫细胞化学采用各种有效方法最大限度 保存细胞和组织内待检物质的抗原性，采用各种增 敏方法，使用高度敏感的和高亲和力的抗体，保证 可检出细胞内超微量的抗原分子，用显微镜和电子 显微镜观察结果，因此，它是在细胞、分子水平或 基因水平的检测技术。;　 3. 高分辨能力 免疫组织（细胞）化学经呈色反应，形成有色沉淀或荧光，可检测出细胞和组织内超微量抗原成分 4. 方法步骤统一 　　若掌握一种技术操作方法步骤，则一通百通。 　 5. 形态、机能和代谢密切结合 　　是一种综定性、定位和定量密切结合；形态、机能和代谢密切结合为一体的研究和检测技术。;缺点：;　　免疫细胞化学技术在细胞、染色体或亚细胞水 平原位检测抗原分子，是其它任何生物技术难以达 到和代替的，它能在细胞、基因和分子水平同时原 位显示基因及其表达产物，形成了新的检测系统， 为生物学、医学和各个领域分子水平的研究与诊断， 开拓了广阔的前景。;　　免疫细胞化学技术日新月异，以惊人的速度发 展，尤其是和分子生物学的理论和技术日益结合密