第五章细菌检验技术研讨.pptVIP

【操作】 1.分区划线分离法（用于细菌标本的分离纯化。） 五段分区法 孵育后情况 单菌落（clone 菌苔 lawn 二、染色细菌标本检查法 －－染料 细菌染色用的染料 酸性染料（阴离子染料）：染色离子带阴电荷，能与带阳电的物质结合，使之着色。降低菌液的pH而使细菌带阳电时，就可用酸性染料染色。（伊红、刚果红） 碱性染料（阳离子染料）：与带负电的物质结合，细菌一般带负电，所以细菌染色所用的染料，常用碱性染料（碱性复红、美蓝）。 复合染料：碱性染料与酸性染料的结合物（伊红美蓝、伊红天青）。 单纯染料：不能与被染物生成盐类 影响染色的因素 细菌的结构：细胞壁的结构、细胞膜的通透性、膜孔的大小 培养基：组成、菌龄、pH 染色细菌标本检查法 －－制片方法 制片：（制片是染色的关键，如不注意菌体涂布的均匀度，会造成染料的大面积堆积，而使观察结果不理想） 制片：在干净的载波片（平时放在95%酒精中 上滴一滴蒸馏水或无菌水，用接种工具进行无菌操作，挑取培养物少许，置载玻片的水滴中与水混合做成悬液，并涂成直径约1cm的薄层。若材料为液体培养物或自固体培养物中洗下制备的菌液，则可直接涂布于载玻片上。涂布要均匀，菌体间少重叠。 干燥：涂布最好在室温下使其干燥，有时为之使之干燥得快些，小心地在酒精灯火焰高处微微加热。 固定：标本干燥后即进行固定，标本向上，在酒精灯火焰外层尽快地来回通过3～4次，共2～3s，并不时以载玻片的加热面触及皮肤，其目的：杀死微生物，固定细胞结构；保证菌体能牢固地黏附在载玻片上，防止标本被水洗掉；改变染料对细胞的通透性，因为死细胞的原生质比活细胞的原生质易于染色。 注意事项： 载玻片要洁净无油，否则菌液涂不开，且固定效果不好，水洗时易被水冲掉。 为避免因菌数过多聚成团而不利于观察个体形态，可在载玻片一端加一滴水，从已涂布的菌液中再取一环于水滴中进行稀释，涂布成薄层。 干燥时，切勿靠火焰太近或加热时间过长，以防标本烤枯而使菌体变形。 细菌染色标本的制作程序 涂 片 干 燥 固 定 染 色 染色细菌标本检查法 －－染色分类 单染色法：用一种染色剂对涂片进行染色。该法简便易行，但仅能显示细胞的外部形态，而不能辨别其内部结构，适用于微生物的形态观察。 复染色法：主要的复杂染色法有革兰氏法和抗酸性及特殊染色法。因为细菌除了具有细胞壁、细胞膜、原生质和核等基本构造外,某些细菌还具有荚膜、芽孢、鞭毛和异染颗粒等特殊结构，这些结构不能被一般染色方法着色，必须用特殊的方法才能着色。 负染色法：负染色法是一种特殊的染色方法，是指背景着色而细菌本身不着色。一般使用酸性染料，如刚果红或水溶性苯胺黑。固定染色涂片可浸于酸性酒精中，因刚果红经酸性酒精处理后，涂片的背景便从红色（盐类的颜色）转变为蓝色（即刚果红游离的颜色），这样可使对比性更为鲜明。 负染色法除用于观察细胞形态外，还可区别死菌与活菌，因死菌可被酸性染料着色，部分自溶的细菌也能轻度染上酸性染料，而活菌却不着色。 染色细菌标本检查法 －－简单染色方法 菌名 染色液名称 菌体颜色 菌体形态（图示） 大肠埃希氏菌 金黄色葡萄球菌 步骤： 结果: 阳性菌——紫色 阴性菌——红色 结晶紫初染 碘液媒染 乙醇脱色 复红复染 涂片固定 由丹麦医生Hans Christian Gram于1884年创立。 革兰染色法（Gram Stain） 革兰染色法（Gram stain） 方法（改良快速法） 初染： 结晶紫＋等量NaHCO3 3～5s，水洗 媒染： 碱性碘液 3～5s，水洗 脱色： 丙酮酒精 3～5s，水洗 复染： 碱性稀释复红 3～5s，水洗 结果 紫色：革兰阳性菌 红色：革兰阴性菌 染色细菌标本检查法 －－革兰氏染色法 注意事项： 单一菌落染色后看到红色杆菌和紫色杆菌共存的情况，特别明显既有红色的，也有紫色的？（脱色时间：受涂片之厚薄、脱色时玻片晃动的快慢及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定。菌龄：选用培养18～24h菌龄的细菌为宜。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应） 显微镜观察：紫和红好象都是，焦距调的稍近时紫色，调的稍远时红色，两种情况下形状都看的挺清楚，杆状。关于颜色你们怎么确定的？ （对照：当确证一个未知菌的革兰氏反应时，应同时做一张已知革兰氏阳性菌和阴性菌的混合图片） 染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应甩去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。 用洗衣粉水煮沸、清洗、沥干备用。 结果记录： 菌种 菌体颜色 菌体形态 G+ 或 G- 大肠埃希氏菌 金黄色葡萄球菌 细菌未知种 附 拉丝试验 原理：革兰阴性菌的细胞壁在稀碱溶液中容易破裂，释放出未断裂的DNA螺旋，使菌液呈粘性。 方法： 结果：有丝出现（拉丝试