课用双向电泳技术预案.ppt

双向电泳技术;一、蛋白质双向电泳相关基本知识 二、双向电泳 1、2-DE常见问题及解决方法 2、对角线电泳SDS/SDS 3、Native/SDS 三、2D-LC;一、蛋白质电泳相尖基本知识;1809年俄国物理学家Peйce首次发现电泳现象。*1909年Michaelis首次将胶体离子在电场中的移动称为电泳。他用不同pH的溶液在U形管中测定了转化酶和过氧化氢酶的电泳移动和等电点。;*1937年瑞典乌普萨拉 （Uppsala）大学的Tiselius对电泳仪器作了改进，创造了Tiselius电泳仪，建立了研究蛋白质的移动界面电泳方法，并首次证明了血清是由白蛋白及α、β、γ球蛋白组成的，由于Tiselius在电泳技术方面作出的开拓性贡献而获得了1948年的诺贝尔化学奖;70年代以来，电泳技术围绕制胶、电泳、染胶三大环节，不断改进，以实现下列目标： 1、提高分辨率及灵敏度。 2、简化操作，缩短电泳时间。 3、扩大应用范围。 各类电泳技术已广泛应用于生命科学各个领域。;一、电泳的基本原理 1、电泳是在电场作用下产生的物质运动，不同的物质在一定的电场强度下，由于所带电荷不同，因此受到的引力不同，向相反电极泳动速度不同进而达到分离目的，称为电泳（electrophoresis)。 ;从上式看出，带电颗粒的泳动速度同电场强度E和分子本身所带的净电荷量Q成正比，与颗粒半径r和介质黏度η成反比。 蛋白质是一种两性电解质。其泳动速度取决于蛋白质分子所带电荷的性质、数量以及颗粒的大小和形状。;;;二、影响电泳速度的因素 1、电场强度；2、缓冲溶液的pH；3、缓冲溶液的离子强度；4、电渗；5、焦耳热 三、电泳的分类 按原理分类： 自由界面电泳：又称移动界面电泳，是指在没有支持介质的溶液中进行的电泳。其装置复杂，价格昂贵，费时费力，不便于推广应用。 区带电泳：是指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。支持介质的作用主要是防止电泳过程中的对流和扩散，以使被分离的成分得到最大分辨率的分离。区带电泳由于采用的介质不同以及技术上的差异，又可分为不同的类型。; ??按支持介质种类的不同，区带电泳可分为 ①纸电泳：用滤纸作为支持介质，多用于核苷酸的定性定量分析。 ②醋酸纤维素薄膜电泳：医学上，常用于分析血清蛋白、胎盘球蛋白，其优点是简便迅速，便于保存照相，比纸电泳分辨率高。 ??以上二种类型的电泳，由于介质的孔径度大，没有分子筛效应，主要靠被分离物的电荷多少进行分离。 ;③淀粉凝胶电泳：多用于同工酶分析，凝胶铺厚些，可一层一层剥层分析（一板多测）。天然淀粉经加工处理即可使用，但孔径度可调性差，并且由于其批号之间的质量相差很大，很难得到重复的电泳结果，加之电泳时间长，操作麻烦，分辨率低，实验室中已很少使用。 ④琼脂糖凝胶电泳：一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。 ⑤聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。其分辨率较高。 聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质。;?? 另外根据支持介质形状不同，区带电泳可分为：薄层电泳、板电泳、柱电泳。?? 根据用途不同，可分为：分析电泳、制备电泳、定量电泳、免疫电泳。 按pH的连续性不同，可分为：连续pH电泳，不连续pH电泳。 ;四、聚丙烯酰胺凝胶电泳;; 1、丙烯酰胺凝胶有以下优点： ①几乎无电渗作用。 ②化学性能稳定，与被分离物不起化学反应。对pH和温度变化较稳定。 ?在一定浓度范围内凝胶无色透明，有弹性，机械性能好，易观察。 ?凝胶孔径可调。 ?分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体，因而有更高的分辨率。;2、聚丙烯酰胺凝胶的聚合;;;;;;;;聚丙烯酰胺凝胶电泳的异常现象及解决办法 1.凝胶未聚合 2.未加水层时凝胶聚合 3.电泳后未能检测出样品 4.样品分离区带宽或拖尾 5.只显一条区带 6.分离区带呈条纹状;第二节 蛋白质等电聚焦电泳; 利用蛋白质分子或其他两性分子等电点的不同，在一个稳定的、连续的、线性的（或非线性）pH梯度中进行蛋白质的分离和分析。分析对象只限于蛋白质和其他两性分子。 根据建立pH梯度原理不同，可分为载体两性电解质pH梯度（carrier ampholyte pH gradient)和固相pH梯度(immobilized pH gradient, IPG)。;一、基本原理;2、聚焦效应;二、载体两性电解质pH梯度等电聚焦电泳;2、载体两性电解质pH梯度的形成 ;3、载体两性电解质分离原理;三、固相pH梯度等电聚焦电泳技术;1、固相pH梯度的介质;2、固相pH梯度的建立;