DBI讲座--qPCR技术--细节决定成败.pptVIP

中国科学院生物化学与细胞生物学研究所博士 DBI Bioscience 5年 资深专家 党希龙 程涛;DBI Bioscience主要做什么？我们有哪些优势产品？;我们为中国的客户带来更好的..........;我们的生产地——路德维希港（德国）;;严谨、科学、质量可靠，技术先进、 选材严格，良好的技术性和耐久性、不计成本;qPCR Mix 对比实验;3种qPCR Mix包括：;模板： 人源 cDNA 引物： IC 1 (for SYBR Green);Tak公司 SYBR Premix Ex Taq;Tak公司 SYBR Premix Ex Taq;总结 1;第2部分 qPCR mix扩增miRNA的效果比较;;miR-18a-5p;miR-141-5p ;miR-139-3p ; 当引物特异性较好(溶解曲线为单峰)时，4种mix之间扩增效果没有明显区别，Ct值也较为接近； 当引物特异性不够时(溶解曲线出现双峰等)， 4种mix扩增效果差异较大，整体说来DBI StormStar和DBI BeStar比Tak公司(A3701)Tak公司(A4504)的Ct值更小 ； Tak公司 mix两个批次之间(A3701和A4504)没有明显差异； DBI BeStar与两种Tak公司 mix没有明显差异； 使用质量较差的引物时， DBI StormStar具有更高的特异性(相比另外3种mix)；;SYBR Green mix 检测批次： BesStar SybrGreen qPCR Master Mix -619（DBI-2043） BesStar SybrGreen qPCR Master Mix -621（DBI-2043） BesStar SybrGreen qPCR Master Mix-623（DBI-2043） SYBR Green qPCR Master Mix（Tak公司，A4504）;3.1. Ct值比较;miR-1;miR-22-3p; 当引物特异性较好(溶解曲线为单峰)时，4种mix之间扩增效果没有明显区别，Ct值也较为接近； 当引物特异性不够时(溶解曲线出现双峰等)， DBI三种mix扩增效果没有明显区别，但Ct值数据都小于Tak公司 mix； 使用质量较差的引物时， 选用DBI mix可以得到更优的数据，但需补充阴性对照数据来进行判定；;使用DBI Bioscience的qPCR(SYBR GREEN)最近发表的文章（影响因子20.22分）;内容概要;实时定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析; 扩增曲线 荧光阈值 Ct值; 在PCR反应中，DNA扩增过程遵循酶的催化动力学原理。 反应初期，目的DNA片段呈指数扩增。随着目的DNA产物逐渐积累，在引物一模板与DNA聚合酶达到一定比例时，酶的催化反应趋于饱和，此时扩增DNA片段的增加减慢进入相对稳定状态，即出现“停滞效应”，又称“平台期”。到达平台期所需PCR循环次数取决于样品中模板的拷贝数、PCR扩增效率、DNA聚合酶种类和活性、以及非特异产物的竞争等因素。到达平台期前，TaqDNA聚合酶一般要进行25次以上PCR循环。 多数情况下，平台期在PCR反应中不可避免。 ; PCR产物的积累规律示意图;荧光定量PCR定量原理;荧光定量PCR定量原理;荧光定量PCR定量原理;Ct值的定义： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数; 前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline） 荧光阈值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍 手动设置：大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值；进入指数期的最初阶段 真正的信号:荧光信号超过阈值;定量PCR的数学原理;;定量PCR的数学原理;定量PCR的数学原理;线性关系、扩增效率确认;内容概要;非特异性荧光标记 SYBR Green I 特异性荧光标记 TaqMan Probe ;;热 变 性;问题点： SYBR Green I与双链DNA进行结合后散发荧光，因 此如果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生， 也将 同时被检测到，从而可能导致检测结果不准确。 ;将温度与荧光强度的变化求导 (-dI/dT);融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光 定量准确; 对DNA模板没有选择性 使用方便，不必设计复杂探针 具有价格优势;Taqman探针法——原理;;1、引物、探针的设计： 探针Tm为68-70℃ ，30 bp, 5’不能有G，G可能会淬灭荧光素，