《DNA的粗提取与鉴定》介绍.pptVIP

* 讨论2：怎样才能将细胞内的这些物质分离出来？ 讨论1：构成生物体的遗传物质是什么？ 1、提取生物大分子的基本思路 （一）提取DNA的方法 一、基础知识 2、提取DNA的基本思路 利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分 DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同。 （1）DNA的溶解性 溶解度 NaCl浓度 0.14mol/L 曲线解读： 1、在NaCl溶液浓度低于0.14 mol/L时，DNA的溶解 度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐降低； 2、在0.14 mol/L时，DNA溶解度最小； 3、当NaCl溶液浓度继续增加时，DNA的溶解度又 逐渐增大。 利用该特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离的目的。 （2）DNA在酒精溶液中的溶解性 DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步分离 （3）DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性 ① 蛋白酶——水解蛋白质， 对DNA没有影响 ② 高 温——大多数蛋白质不能忍受60～80℃ 而DNA在80℃以上才会变性 ③ 洗涤剂——溶解细胞膜，去除脂质和蛋白质 但对DNA没有影响 试剂： （二）DNA的鉴定 条件： 二苯胺 沸水浴条下，DNA遇二苯胺被染成蓝色 沸水浴 现象： （一）实验材料的选取 （二）破碎细胞，获取含DNA的滤液 （三）除去滤液中的杂质(纯化) （四） DNA的析出与鉴定 二、实验设计 （一）实验材料的选取 1、材料：鱼卵、猪肝、菜花、香蕉、鸡血、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、在液体培养基中培养的大肠杆菌。（从中选取2～3种实验材料） 2、原则：选用DNA含量相对较高、容易提取的生物组织。 鸡血 3、合适的材料： （二）破碎细胞，获取含DNA的滤液 1、动物细胞 2、植物细胞 ——容易破碎 ——需要溶解细胞膜 鸡血细胞溶液： 加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液 想一想：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？ 蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体， 水分大量进入血细胞，使血细胞胀裂； 加上搅拌作用，加速鸡血细胞细胞膜、核膜破裂，从而释放出DNA ① 加入一定的洗涤剂和食盐 ② 充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液 想一想：洗涤剂和食盐的作用分别是什么？ 洗涤剂——离子去污剂，能溶解细胞膜，利于DNA释放 食 盐——NaCl，利于DNA的溶解于研磨液中 经研磨可破碎细胞壁，使细胞核内的DNA释放。若研磨不充分，会使提取的DNA量变少，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。 为了纯化提取的DNA需要将滤液作进一步处理 讨论：滤液/研磨液中可能含有哪些成分？ 答：可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质 想一想：研磨的目的是什么，如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？ 为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质 （三）去除滤液中的杂质 方案一、在滤液中加入NaCl，使NaCl溶液浓度为2mol/L，过滤除去不溶的杂质，再加入蒸馏水，调节NaCl溶液浓度为0.14mol/L，析出DNA，过滤除去溶液中的杂质，在用2mol/L的NaCl溶液溶解DNA。 答：用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐溶液中不能溶解的杂质；用低盐溶液使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质 讨论：方案二与方案三的原理有什么不同？ 方案二、直接在滤液中加入嫩肉粉，反应10～15分钟。 方案三、将滤液放在60～750C的恒温水浴箱中保温10～15分钟。 具体做法: 方案一：30mL滤液＋35gNaCl→同方向搅拌，DNA溶解→加入蒸馏水→DNA析出→过滤得到过滤物→放到2mol/LNaCl溶液中溶解→DNA-NaCl溶解液 方案二：30mL滤液＋嫩肉粉（木瓜蛋白酶）→静置10～15分钟→DNA滤液 方案三：30滤液→60～75℃处理→过滤获得DNA滤液 （四） DNA的析出与鉴定 与滤液体积相等的冷却的酒精溶液(体积分数95％)，静置2－3min，溶液中会出现白色丝状物 ——粗提取DNA 用玻璃棒沿一个方向搅拌， 卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水 1、DNA的析出 2. DNA的鉴定 溶解丝状物的溶液变为蓝色 ⑴ 向两支试管中分别加入 2mol/L NaCl 溶液5ml ⑵ 其中一支试管中加入DNA丝状物 ⑶ 各加入二