第6章 重组DNA导入受体细胞.pptVIP

第六章 重组DNA导入受体细胞的方法;1.DNA导入细菌的方法 2.DNA导入酵母的方法 3.DNA导入植物细胞的方法 4.DNA导入动物细胞的方法 ;转化 转染 转导 接合转移;I. 化学诱导感受态法; Ca2+处理的感受态细胞，其转化率一般能达到106～108转化子/?gDNA。 化学法简单、快速、稳定、重复性好，感受态细菌可以在-70℃保存，但转化DNA大小有限制，不同物种需要不同的诱导方法。 转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。;培养大肠杆菌;10ng质粒DNA;II.电转化;LB培养受体菌至OD600=0.5-0.6;用于电穿孔转化法的细胞处理要比感受态细胞的制备要容易，当细菌生长到对数中期后予以冷却、离心，然后用低盐缓冲液充分清洗降低细胞悬浮液的离子强度，并用10%甘油重悬细胞，使其细胞浓度为3×1010个／ml，分装，在干冰上速冻后置于-70℃贮存。每小份细胞融解后即可用于转化，有效期达6个月以上 一般电穿孔转化须在低温下（0～4℃）进行，转化效率要比在室温下操作提高约100倍。 由于细菌细胞相对较小，因此与 DNA导入真核细胞时相比，大肠杆菌的电转化要求有更高的场强，而反应体积则相对要小，以20～40μl为宜。;磷酸钙-DNA共沉淀法：简称磷酸沉淀法，属于转染法，能把外源基因与λ噬菌体DNA的重组子导入大肠杆菌和哺乳动物细胞，但转染效率远远不如体外包装法（转导）。 　　 HEPES缓冲盐水与含有氯化钙和DNA的溶液缓慢混合，会形成含磷酸钙和DNA的沉淀。 细胞具有摄取磷酸钙沉淀的双链DNA的能力，几乎所有的双链DNA都可以通过这种方法导入细胞。 对数生长期的细菌和重组λ噬菌体磷酸钙-DNA沉淀混合，先置0℃冰浴30～60分钟，再放45℃中水浴5分钟，使细菌迅速发生热休克，以利外源DNA的进入。随后涂布琼脂平皿，培养后观察并选取含有重组DNA的细菌。 　　 ;;（2）枯草芽孢杆菌;在枯草芽孢杆菌中，转化的过程包括外源DNA的吸附、断裂、吸收降解和重组（或形成独立的复制单元，如质粒）几个阶段： 吸附：这一过程发生在感受态细胞的表面，是一个非共价结合的过程。在枯草芽孢杆菌的感受态细胞表面平均约有50个DNA吸附位点，这些位点对双链DNA有非常大的亲和力 双链DNA的断裂：在吸附发生后的30秒内，DNA被核酸酶随机断裂，其平均长度约为7kb。 DNA的降解和吸收：在断裂发生之后，双链DNA的一条链被完全降解，另一条链穿过细胞壁和细胞膜后进入胞内。 合成双链并环化：变成双链后依靠同源区环化。自身无同源区段（重复序列）的DNA，转化效率极低。对于质粒单体，需要体外酶切、连接成质粒多聚体才能高效转化。103~105个/?g DNA ; 原理：用溶菌酶等处理消化部分细胞壁，制备原生质体，在PEP(聚乙二醇）等促溶剂作用下使细胞膜形成小孔，胞外DNA通过小孔进入胞内,然后在再生培养基上筛选转化子。 ;2. 酵母菌的转化方法;（2）碱金属离子介导的酵母菌转化 酿酒酵母经碱金属离子（如Li+等）、PEG热休克处理后，也可高效吸收质粒DNA，而且具有以下特性： 吸收线性DNA的能力明显大于环状DNA，二者相差80倍,共转化现象较为罕见。;其他导入技术： 接合转移;三亲杂交接合转移 重组质粒从大肠杆菌转移到土壤农杆菌;叶盘;植物细胞;又称高速微型子弹射击法（High-velocity microprojectiles) 以冷压缩气体为动力将吸附DNA的金属微粒打入细胞内，完成基因转移，适合各种细胞（微生物、动植物）。 快速、简便、安全、高效。还可以导入细胞（如内生菌）、蛋白、细胞器、细胞核等。;原理（略）;脂质体有商业试剂盒（如Life Technologies）。;利用显微注射仪直接把DNA注射到宿主细胞或细胞核里，使其整合到染色体上。 一般细胞一端被微吸管固定，从另一端注入DNA（10pl );二乙氨乙基（diethyl-aminoehtyl，DEAE）葡聚糖，一种多聚阳离子试剂，能促进哺乳动物细胞摄入外源DNA，实现瞬时有效表达。