第二章 DNA的复制-分子生物学.pptVIP

第二章 DNA的复制;一、DNA 复制假说;;Meselson－Stahl实验;;15N-DNA; 对15NDNA、14NDNA杂交分子经加热变性，对于变性前后的DNA分别进行CsCl密度梯度离心。;;＊ 1963年Cairns用放射自显影方法阐明了大肠杆菌DNA的复制是半保留复制且DNA是环状分子。;;;二、半保留复制;模板 原则 特点;;;2、DNA半保留复制的类型;2） 环状DNA：θ型（双向、单向）、 D型、滚环;;φX174RF是一个合成单链病毒圆环的模板;D型复制;3、参与DNA复制的物质;4）DNA聚合酶（DNA Polymerase）： 以dNTP为前体催化合成DNA 需要模板和引物的存在 不能起始合成新的DNA链 催化dNTP加到生长中的DNA链的3’-OH末端 催化DNA合成的方向是5→3;A 原核生物聚合酶; 3’ 5’ 5’ 3’ 外切酶 聚合酶;5‘－3’聚合活性： ? 模板； ? 3‘－OH末端引物； ? 方向从5’－3‘。;复制方向;5’－3‘外切酶活性： ? 从5’-P端依次切除，可连续切除多个核苷酸； ? 只切配对的5’-P末端核苷酸； ? 既可切除脱氧核苷酸也可切除核苷酸； ? 对只有5’末端的切口也有活性。;;MW为120KD 100个酶分子/每个细胞 聚合作用:只有DNApolⅠ的5% 3’→5’外切酶活性 无5→3外切酶活性 对作用底物的选择性较强 不是复制的主要聚合酶;pol Ⅲ由十种共22个亚基组成 α亚基具有5’→3’聚合DNA的酶活性 ε亚基具有3’→5’外切酶的活性 θ亚基具有促进ε亚基外切酶的活性;在复制叉处为一二聚体 核心酶（core enzyme）：α、ε、θ。 α：聚合作用； ε：3’－5’外切；θ：与亚基结合有关； γ、δ、δ’、χ、ψ提高反应速率和持续性； β：使DNApol能结合在DNA上。β亚基结合于DNA时消耗ATP；如同一个夹子，使DNApolⅢ结合于DNA。 τ：使两个DNApol单体形成二聚体，分别在复制叉的两个链上作用。;DNA Polymerase III Holoenzyme;;;;B 真核生物聚合酶; DNA聚合酶 α β γ δ ε 蛋白质分子量（KD） 250 36-38 160-300 170 256 细胞定位 核 核 线粒体 核 核 ? 5’ →3’聚合酶 有 有 有 有 有 3’ →5’外切酶 无 无 有 有 有 引物酶 有 无 无 无 无 ;5） 解链酶（unwinding enzyme/ helicase ） ;;6） 引物酶（Primase）;;蛋白因子i、n、n”与蛋白dnaC跟引物预合成有关； 蛋白因子n’和蛋白dnaB与识别复制起始点有关，并具有ATPase活性。;7）单链结合蛋白;;;8） 拓扑异构酶(topoisomerase)： 可使DNA拓扑异构体互变的酶。;? 功能：与DNA形成共价结合中间体，使DNA磷酸二酯 键断裂，形成DNA nick，DNA的一条链进行解 旋旋转改变DNA分子的拓扑结构。 参与复制、转录、重组。 ? 效应：可使DNA发生：连环化（catenate）、脱连环化 （decatenate）、打结（knot）、解结（unknot）。;拓扑异构酶Ⅰ：MW＝100kD，单肽链，含3－4个Zn;;作用： 使正超螺旋转化为负超螺旋。每次改变两个连接数。;;;Ⅰ型：MW＝95kD，单体蛋白，不需ATP； Ⅱ型：MW＝150－180kD，均为二聚体，需ATP和 Mg2+。;9） 连接酶;DNA连接酶的作用;? T4Ligase特性： 可连